骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量下降、骨组织微结构破坏为特征，使骨脆性增加，易发生骨折的代谢性骨病[1].随着人口老龄化，其发病率呈逐年上升趋势。氧化应激被认为是参与骨质疏松发生、发展的一个独立危险因素[2].氧化应激与绝经后骨质疏松、糖皮质激素性骨质疏松和糖尿病性骨质疏松发生、发展密切相关[3-5].骨质的完整性依赖于成骨细胞的骨形成功能与破骨细胞的骨吸收功能的平衡[6],氧化应激可影响成骨细胞功能。本文就氧化应激影响成骨细胞功能的研究进展作一综述。

　　体内研究

　　活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)聚集、增加可致氧化应激，其具有双重作用，可氧化、破坏蛋白质、脂质、DNA,导致细胞功能改变，也可激活胞内多重适应性信号通路[7-10].细胞内存在抗氧化系统，其中铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)发挥重要作用，它由sod1基因编码[11-12].有文献报道，随年龄增长，sod1基因敲除小鼠表现为明显骨量下降、骨胶原交联异常，sod1敲除鼠成骨细胞数量、类骨质表面积、矿化物表面积、骨形成率显着下降[13],提示sod1基因敲除可致成骨细胞增殖、存活和分化功能下降。提取sod1基因敲除鼠原代成骨细胞进行体外培养，发现sod1敲除鼠成骨细胞胞内ROS含量显着增加、成骨细胞增殖下降、凋亡增加。应用抗氧化剂维生素C可逆转sod1基因敲除对小鼠骨代谢及成骨细胞功能的影响，提示sod1敲除鼠骨表型改变主要原因是氧化应激增加，而非sod1基因缺失所致。

　　体外研究

　　ROS与细胞凋亡H2O2作为ROS的主要成分，可诱导凋亡相关基因AIF、Bax和caspase-3,9表达，诱导成骨细胞凋亡[14].氧化应激可诱导成骨细胞凋亡已被广泛认可[15-16],但ROS致成骨细胞凋亡的具体分子机制尚未明确。有研究发现H2O2可激活胞外信号调节激酶(ERK)表达，而应用ERK上游信号MEK1/2抑制剂PD98059不仅可降低成骨细胞凋亡率，还可改善H2O2诱导的Bax表达增加和线粒体膜电位超极化[17].提示ERK作为线粒体依赖途径的上游信号启动凋亡信号，在H2O2诱导成骨细胞凋亡过程中发挥积极作用。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4(Nox4)是产生ROS的重要酶类，H2O2可诱导MC3T3-E1细胞氧化应激增加、Nox4表达上调和凋亡增加，应用辛伐他汀和RNAi技术沉默成骨细胞Nox4表达后，H2O2诱导的细胞损伤显着下降，提示在一定程度上辛伐他汀可通过抑制Nox4表达上调从而保护成骨细胞免受H2O2损伤.ROS的另一主要来源是线粒体，抗毒素A可通过线粒体依赖途径增加成骨细胞凋亡、ROS生成，降低线粒体功能，而用白芍苷预处理后细胞色素C、心磷脂、线粒体功能增加，最终减弱抗毒素A对成骨细胞的氧化损伤.

　　ROS与细胞增殖

　　H2O2可抑制成骨细胞增殖，应用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后成骨细胞增殖明显改善[20].Wang等研究发现不同浓度氟化钠干预成骨细胞后其胞内ROS水平上升、增殖下降、细胞阻滞在S期(DNA合成期),提示氟化钠可能通过增加细胞氧化应激抑制增殖、阻滞细胞生长，而另一研究发现维生素D所致的ROS增加在一定程度上可促进人成骨细胞系SaOS2增殖和能量代谢[22].提示ROS的作用可能与胞内ROS水平、作用时间有关。转录因子FoxO可保护多种细胞免于ROS损伤，在成骨细胞系中FoxO1可增加细胞增殖、分化，减少凋亡。FoxO1作为miR-182的作用靶点，其表达可被miR-182抑制，从而降低成骨细胞增殖和分化，损害骨生成[23].

　　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调节细胞增殖的关键信号分子[24],Lia等[25]研究发现小剂量、短时间H2O2刺激可诱导成骨细胞ROS增加从而活化mTORC1,促进细胞增殖。而大剂量、长时间H2O2刺激诱导胞内ROS明显增多，mTOR表达下调，抑制细胞增殖，该过程与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的调控相关蛋白(Raptor)(S792)磷酸化密切相关。而另一研究则认为H2O2可通过下调细胞周期蛋白B1(cyclinB1)表达、诱导G(2)细胞周期阻滞抑制细胞增殖，H2O2抑制mTOR信号通路在其降低细胞增殖的过程中并无作用[26].

　　ROS与细胞分化大量研究证明H2O2可影响成骨细胞分化[27-28].Zhang等[29]指出高糖所致的成骨细胞ROS水平增加可提高碱性磷酸酶(ALP)活性，降低矿化功能，下调Runt相关转录因子2(Runx2)、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白基因表达，促进过氧化物酶增殖受体γ(PPAR-γ)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(ap2)基因表达，ROS的以上作用可被NAC逆转。高糖环境下ROS通过激活PI3K/Akt信号通路从而抑制成骨分化，促进成脂分化。Arai等[28]发现，与正常对照组相比，暴露于单一H2O2无毒浓度的成骨细胞矿化功能下降50%,调节抗氧化酶的转录因子Nrf2基因表达上调，成骨标志物Runx2、ALP和骨涎蛋白(BSP)基因表达显着降低，提示ROS致成骨细胞分化下降与抗氧化酶系统表达上调和成骨基因表达改变密切相关。Arakak等[30]发现用促分化培养基培养MC3T3-E1细胞14d,细胞矿化和ALP、骨钙蛋白基因表达显着上升，细胞线粒体形态学不断从网状向碎片状变化，胞内ROS含量明显增加，而正常培养条件下成骨细胞无明显变化。用NAC处理后ROS水平、成骨细胞分化功能呈剂量依赖性下降。提示ROS作为胞内信号分子，其作用在成骨细胞分化过程中必不可少。

　　ROS与自噬

　　自噬与自噬相关分子：自噬(autophagy)是溶酶体降解胞内衰老、损伤的细胞器和部分蛋白质、糖类等的一种程序性细胞死亡过程，是细胞对环境的有效反应，以维持细胞自身稳定。该过程由自噬相关基因(autophagyrelatedgene,Atg)调控，Atg最早在酵母菌中发现，目前已发现34种Atg,其中大部分都能在哺乳动物中找到同源基因，如Atg1同源基因是ULK(UNC-51likekinase)家族蛋白ULK1和ULK2,Atg17同源基因是FIP200(focaladhesionkinasefamilyinteractingproteinof200kDa)、Atg6(Beclin1)、Atg8(LC3).这些基因相互联系，如ULK1/2-mAtg13-FIP200复合物的形成可促使细胞自噬的发生[31-32].Atg4可分割微管相关蛋白1轻链3(LC3)前体形成LC3Ⅰ，随后由Atg7依赖的泛素化样系统加工，生成膜结合形式LC3-Ⅱ，最终将LC3Ⅱ粘连在自噬体膜上，该过程是细胞自噬的一个重要过程，因此LC3-Ⅱ被广泛作为自噬标志物，其表达水平的高低和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化代表了自噬活性的强弱[33].LC3-Ⅱ和Atg12-Atg5结合体是自噬体膜的标志性蛋白质，共同反映自噬活性。p62/SQSTM1是一种泛素结合蛋白，可与LC3相互作用从而介导哺乳动物细胞中泛素化蛋白质通过自噬途径被溶酶体降解[34],其表达增加表明自噬活性下降，反之自噬活性增加，它可以作为检测自噬流量大小的标志物[35].

　　自噬与mTOR:mTOR是一种保守的丝/苏氨酸激酶，有mTORC1和mTORC2两种活性形式，它作为细胞内的中心信号调节因子，可接受激素、能量、氧化应激等多种信号刺激[36-40].其中mTORC1在调节细胞生长、细胞凋亡、能量代谢和细胞自噬等方面发挥重要作用[31,41],mTORC1可通过磷酸化、调节下游信号分子丝/苏氨酸核糖体蛋白S6激酶1(S6K1),继而激活S6,从而选择性增加编码核糖体蛋白和转录调节因子的mRNA翻译[42],抑制自噬小体形成。mTOR受多种上游刺激因子调控，如AMPK、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)等，其中AKT/mTOR/p70S6K信号通路可负性调节自噬[43-44].mTOR/p70S6K信号通路可调节多种细胞自噬功能[45-46],然而其与成骨细胞自1[47]研究发现，无血清培养条件下MC3T3-E1细胞自噬相关基因LC3,beclin1和ULK1及其蛋白表达显着增加，应用雌激素后自噬进一步增强，且雌激素的该作用与mTOR磷酸化受抑制有关。

　　ROS与细胞自噬：近年细胞自噬与肿瘤、神经系统疾病、慢性代谢性疾病如糖尿病、骨质疏松等的关系备受关注。无论是正常细胞还是肿瘤细胞，胞内ROS水平增加均可诱导自噬[48-49].Lu等[50]研究显示小白菊素可诱导乳腺癌细胞产生ROS,从而激活凋亡和AMPK-自噬通路。那么ROS与成骨细胞自噬之间又有何关系呢?体外研究[51]发现H2O2可激活MG63细胞AMPK信号通路，增加胞内氧化应激，促进自噬，且H2O2所致的自噬增加与AMPK依赖的ULKI激活和mTORC1抑制有关。Alberto等[52]发现高糖环境下成骨细胞自噬与胞内ROS水平密切相关。暴露于高糖培养基中的MC3T3-E1细胞ROS含量、氧化蛋白、自噬显着增加，应用NAC后，成骨细胞的以上变化均被逆转，提示高糖环境下成骨细胞ROS增加可致自噬增加。

　　在正常培养条件下Atg7基因沉默的成骨细胞胞内ROS产量和细胞凋亡显着增加，提示自噬功能受损可能增加胞内ROS,加重细胞氧化损伤。目前高糖环境下ROS影响成骨细胞自噬功能的具体分子机制尚未阐明，可能与mTOR信号通路抑制相关。

　　自噬与细胞凋亡：自噬和凋亡关系密切[47].为进一步探讨高糖环境下成骨细胞凋亡和自噬之间的相互联系，Alberto等[52]应用化学抑制剂和基因沉默等方法，发现高糖环境下自噬抑制剂组和Atg7基因沉默组较单纯高糖组成骨细胞凋亡率显着增加，应用NAC后，以上各组成骨细胞活性增加、凋亡减少，提示高糖环境下自噬增加作为一种保护机制使细胞免于氧化损伤，降低细胞凋亡。

　　Yang等应用无血清培养诱导MC3T3-E1细胞凋亡、自噬，并用雌激素干预无血清培养的成骨细胞，发现雌激素可显着减少细胞凋亡，增强细胞自噬，且雌激素可通过ER-ERK-mTOR信号通路促进成骨细胞自噬从而减少凋亡。

　　自噬与细胞分化、增殖：Alberto等[52]还观察了成骨细胞自噬与分化的相互关系。他们应用RNA干扰技术干扰Atg7表达后，与正常培养基组成骨细胞相比，高糖组的成骨细胞分化特异性基因Runx2、Osx、骨钙素(Osteocalcin)表达和细胞矿化能力显着降低，提示细胞自噬受损可加剧高糖对成骨细胞分化的抑制。目前尚缺乏自噬与成骨细胞增殖间联系的研究。

　　综上所述，骨质疏松作为一种多病因的慢性代谢性骨病，受多因素影响，如激素水平、年龄、血糖和环境等，这些因素可通过一条共同途径-氧化应激，最终影响成骨细胞功能。氧化应激影响成骨细胞功能的分子机制研究虽已取得重大进展，但仍尚未完全阐明。自噬作为一种细胞对环境的适应性改变，也可受氧化应激影响，并可间接影响成骨细胞凋亡、分化，但其对成骨细胞增殖的影响尚待研究。适当降低胞内ROS水平、减轻氧化应激可能改善细胞功能，为骨质疏松的防治提供了可能的理论基础。