[摘要] 目的 了解大鼠对于人胎盘间充质干细胞是否存在天然免疫耐受，分析人胎盘间充质干细胞在大鼠体内出现免疫排斥的可能。 方法 分离提取并鉴定人胎盘间充质干细胞，观察大鼠尾静脉移植人胎盘间充质干细胞后有无出现相关的免疫排斥症状、细胞在大鼠体内的分布情况及脏器的病理改变。 结果 大鼠尾静脉移植人胎盘间充质干细胞后未出现急慢性免疫排斥反应，肝、肾、肺可见标记后的人胎盘间充质干细胞的分布，但相关病理切片未见明显的淋巴细胞浸润和纤维组织增生现象。 结论 人胎盘间充质干细胞与大鼠脏器间存在天然的免疫耐受。
[关键词] 胎盘; 间充质干细胞;免疫排斥
近年来，由于间充质干细胞的研究(Mesenchymal stem cells，MSCs)逐步深入，人们对间充质干细胞移植治疗大面积骨缺损[1-2]、神经系统损伤[3]、卵巢早衰[4]等疾病产生了浓厚的兴趣，而在种类众多的间充质干细胞中，人胎盘来源的间充质干细胞被认为是免疫原性最低的干细胞之一[5-6]，也是目前研究的热点之一，学者们多通过大鼠移植人胎盘间充质干细胞来进行相关疾病的研究[7-10]。然而，对于人胎盘间充质干细胞是否在人鼠间中存在天然的免疫耐受，尚无相关的动物实验基础。因此，为了了解人胎盘间充质干细胞移植对大鼠各脏器功能的影响，客观的分析人胎盘间充质干细胞在大鼠体内出现免疫排斥的可能，避免由于免疫的因素掩盖或降低甚至误导了研究因素的作用，我们对正常大鼠卵巢尾静脉注射移植人胎盘间充质干细胞做了一个初步的研究。
1 材料与方法
1.1主要试剂
DMEM-F12培养基(hyclone)、胰酶(hyclone)、胎牛血清(hyclone)、CO2培养箱(日本三洋)、流式细胞仪(FACSCALIBUR)，PKH26试剂盒(sigma)(089K0781)。
1.2 方法
取足月剖宫产分娩的健康胎儿的胎盘，在无菌条件下剪取小块蜕膜侧胎盘组织，进行人胎盘间充质干细胞的原代培养。取第2代的胎盘间充质干细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，采用流式细胞仪进行胎盘间充质干细胞免疫表型分析。PKH26标记胎盘间充质干细胞，按sigma公司的说明书进行操作。实验分两组，每组10只大鼠，为wista近交系大鼠，体重180～200 g。第一组为对照组，不做任何处理;第二组为尾静脉注射组。移植成功后观察在大鼠体内的分布状况和大鼠一般情况的观察，评估PKH26标记的胎盘间充质干细胞在大鼠体内移植的安全性和可行性。
2 结果
2.1胎盘间充质干细胞的形态观察及生长情况
分离出的胎盘间充质干细胞贴壁生长，细胞呈长梭形，类似于成纤维细胞样，见胞浆突起，胞浆丰富，核大，呈平行排列或旋涡状生长，细胞增殖活跃，约3～4 d 即可铺满全层，可稳定传代。见图1。
2.2 胎盘间充质干细胞免疫表型分析
取第2代细胞进行流式细胞仪检测，结果发现胎盘间充质干细胞表达 CD29，CD44，CD73，CD90、CD105;不表达CD14，CD34(造血干细胞抗原)，CD45(白细胞共同抗原)、CD106、CD133和HLA-DR(MHC-II)，提示所得贴壁细胞为人间充质干细胞， 表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性抗原。见图2。
2.3 胎盘间充质干细胞标记结果
细胞标记后染料在细胞膜上分布均匀一致，在倒置荧光显微镜下呈红色荧光，细胞轮廓清晰。标记百分率为100%。台盼蓝染色细胞的存活率为99%。见图3。
2.4 大鼠移植胎盘间充质干细胞情况
移植组大鼠进食、活动、大小便均与对照组无异，未发现大鼠出现嗜睡、呕吐、抽搐、猝死、无尿、精神状态异常及偏瘫等有关器官栓塞的症状，亦未发现大鼠出现呼吸困难、出血、脱毛、血尿、血便等急慢性免疫排斥反应。
2.5大鼠体内的胎盘间充质干细胞的分布
荧光显微镜下可见PKH26标记后呈红色荧光的胎盘间充质干细胞，均匀分布在肺脏、肝脏及肾脏皮质。肝脏组织可见均匀分布红色荧光，整个肝脏结构组织清晰可见，包括肝脏的胆管和肝脏大血管均可见;在肾脏中亦可见红色荧光细胞主要分布在肾脏皮质，部分肾小体轮廓清晰可见。见图4。
2.6 大鼠相关脏器的病理切片
移植组大鼠肝、肾、大脑、膀胱HE染色后未见明显淋巴细胞浸润和组织结构的破坏，与正常组大鼠未见明显区别。见图5。
3 讨论
间充质干细胞具有多向分化潜能，在体外特定的诱导条件下能向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质甚至肝脏细胞和神经细胞等分化，是目前细胞治疗、基因治疗中理想的种子细胞，在神经系统损伤、卵巢早衰、糖尿病、骨缺损等疾病的治疗中具有极大的应用前景。而在众多种类的间充质干细胞中，尤其以胎盘来源的间充质干细胞优点突出，如来源丰富，易采集，病原微生物感染率和免疫原性较低，无致瘤性和伦理限制等成为目前研究的热点。然而，国内外学者对于间充质干细胞治疗相关疾病的机制研究，多采用动物模型进行实验，虽尚未见急慢性免疫排斥的报道，但并不代表着大鼠对于人胎盘来源的间充质干细胞存在天然的免疫耐受，因为实验中的大鼠多为相关疾病的模型，非正常状态下大鼠。钟志年等[11]选择胎盘间充质干细胞，测定其细胞周期及凋亡率情况，原子力显微镜观察细胞的表面结构，及向成骨细胞诱导分化，探讨胎盘间充质干细胞生物学特性和超微结构，并评价其在骨组织工程学中修复重建的应用前景，结果表明人胎盘间充质干细胞为成纤维细胞样，增殖能力强，9.7%的细胞处于G2/M期或者S期，微结构分析显示其细胞代谢活跃，黏附能力强，能被诱导分化为成骨细胞，结论认为人胎盘间充质干细胞具备适合应用于骨组织工程学的良好生物学特性，并避免了免疫排斥和伦理问题，可望成为骨组织修复重建中的一个新的治疗途径。本次研究我们选择了正常的成年大鼠，移植前后均未用任何药物进行免疫干预。
事实上，人间充质干细胞用于实验动物研究的结果不令人满意，所以近年来有学者使用大鼠胎盘来源的间充质干细胞用于动物实验研究。刘志鹏等[12]通过胶原酶消化法从大鼠胎盘分离并得到间充质干细胞，并建立从大鼠胎盘分离间充质干细胞的方法，观察其基本生物学特性，结果表明，原代细胞培养8 h后细胞贴壁，24 h内细胞形成集落，第4代细胞大小、形态基本一致，以梭形为主，细胞周期检测提示G0/G1期、S期、G2期的比例分别为83.76%，8.01%，8.23%，免疫表型分析其表达CD29和CD90，不表达CD45，结论认为胎盘间充质干细胞具有成脂和成骨分化的潜能。本研究结果也显示大鼠尾静脉移植人胎盘间充质干细胞后1个月，大鼠肺、肝、肾等组织均可见标记了PKH26的人胎盘间充质干细胞的分布，说明移植的人胎盘间充质干细胞在大鼠体内可成功存活。病理切片也显示脑、肝、肾、膀胱等脏器未见明显的淋巴细胞浸润和纤维组织增生现象，说明人胎盘间充质干细胞的移植未对大鼠相关脏器产生免疫排斥影响。整个观察期间大鼠均无明显的急慢性的免疫排斥反应，如呼吸困难、出血、脱毛、血尿、血便等，以上结果均证明大鼠对人胎盘来源的间充质干细胞存在天然的免疫耐受。这种免疫耐受有可能源于胎盘间充质干细胞的低免疫原性甚至是无免疫原性。原因可能与以下因素有关：①胎盘在母儿体内起着重要的免疫屏障和激素分泌的作用[13]，所以胎盘来源的间充质干细胞从理论上讲免疫原性更低，甚至不排除无免疫原性的可能，并且其分泌的免疫调节活性因子，对免疫功能排斥具有调节作用。②人胎盘间充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性。HLA又称移植抗原，能启动免疫应答，参与T细胞的分化，诱导免疫应答，胎盘间充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性提示了其低免疫原性的部分原因。因此，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中，即便是人-鼠间的异种间移植，但由于存在天然的免疫耐受，对实验研究的结果影响甚小。
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