在解剖显微镜下，用镊尖刺破蜗尖骨壁，将分离针探入顶回螺旋韧带与蜗壳之间并沿着螺旋韧带的背侧分离蜗壳，鼓室侧蜗壳较薄，在确保蜗壳与螺旋韧带完全分离后可以轻易摘除已分离的蜗壳;颞骨岩部侧的蜗壳骨壁较厚，则需要先将螺旋韧带与骨壁分离，然后再用剪刀剪除颞骨岩部侧骨壁，直至暴露整个耳蜗膜迷路(图4A、B)。用分离刀探入基底膜底面与骨性螺旋板之间的缝隙中，沿骨性螺旋板将基底膜从鼓阶朝蜗管方向轻抬，使耳蜗基底膜与蜗轴分离，此过程可以从蜗尖开始逐渐向蜗底进行或者从蜗底开始向蜗尖推进。由于基底膜的表面没有骨组织阻挡，分离开的基底膜朝着蜗管方向弯曲不会造成基底膜折断，同时由于操作器械是从基底膜的背面向上抬，因此也不会造成Corti器的机械损伤。取出耳蜗膜迷路之后，可用显微剪将螺旋韧带剪除(图5E)，也可以将基底膜的顶回、中回和底回分别切断，然后再用分离刀沿着基底膜的外侧缘将螺旋韧带切下，最后用游丝镊摘除覆盖在Corti器表面的盖膜(图5F)并完成耳蜗基底膜铺片(图2C、3A)。
解剖前庭各个终器的方法是在摘除镫骨底板后，沿着卵圆窗边缘打开前庭池外壁充分暴露前庭池。在前庭池内壁前下方可见钩形的球囊斑，在前庭池的后上方可见扇形的椭圆囊斑，由于这两个囊斑的表面均覆盖着白色的耳石膜使之成为两个囊斑的最醒目标志，因此很容易辨认。椭圆囊斑和上半规管及外半规管壶腹均位于面神经管内侧深部。需要先打开面神经管外侧壁摘除面神经，再打开面神经管内侧骨壁才能充分暴露椭圆囊的囊斑和两个膜壶腹(图4B)。球囊斑与前庭池内壁的附着较为紧密，需要用分离针探入球囊内侧壁和骨壁之间进行分离，然后取下被分离的整个球囊。椭圆囊和上半规管、外半规管壶腹相对游离，与椭圆囊斑和外壶腹嵴及上壶腹嵴相联系的神经纤维从上筛斑表面的小孔进入骨壁汇聚成前庭上神经束，因此只要将椭圆囊斑和两个膜壶腹进入上筛斑的神经纤维和血管在上筛斑处截断就可以将椭圆囊斑和外半规管及上半规管壶腹取下。后半规管壶腹的位置埋藏在蜗管底回hook后方的骨壁深部(图2A、B)，需要撬开周围骨壁方可暴露，然后将后壶腹通向下筛斑的神经纤维截断即可将后壶腹完整取出。获得所有前庭终器后，还需打开球囊和椭圆囊的囊膜并切除囊斑周围多余的膜性组织，再用游丝镊去除两个囊斑表面覆盖的耳石膜，使两个囊斑表面的感觉毛细胞充分暴露。撕开三个膜壶腹充分暴露壶腹嵴，最后将囊斑和壶腹嵴的正面朝上铺放在载玻片上的甘油滴中，盖上盖玻片(图2D、3B-F)。
2.2软铺片法
经过脱钙处理，骨组织中原先含有的钙盐基质被除去，由于原先坚硬的骨组织变成了软组织，因此脱钙后施行膜迷路取材的难度要比不脱钙取材容易。将颞骨置于盛有蒸馏水的玻璃皿中，以类似不脱钙分离的解剖手法，先分离蜗壳与螺旋韧带，由于骨组织经脱钙后已经变软，分离时需要将分离针沿着蜗壳和螺旋韧带之间的间隙进行分离，同时要注意防止撕扯骨壁，以免牵拉造成耳蜗变形而撕裂基底膜。暴露整个膜迷路后，用游丝镊从听神经孔取下蜗轴。再用游丝镊和分离刀将整条耳蜗基底膜按底回、中回和顶回截成三个片段(图5A-C)。用游丝镊夹持蜗轴，再用分离刀沿着基底膜的内侧缘切除蜗轴(图5D)。然后用分离刀沿着基底膜与螺旋韧带交界处插入，用游丝镊沿着分离刀的刀刃将螺旋韧带与基底膜分开(图5E)。最后用游丝镊摘除盖膜(图5F)并完成耳蜗基底膜铺片(图2C)。由于许多药物造成的耳蜗毛细胞损害都表现出一个从耳蜗底回开始逐渐向耳蜗顶回扩展的病变模式[18-23],因此选自耳蜗基底膜上某一部位的照片并不能有效表达整个耳蜗的病理学改变特征。我们主张在放大400倍的光学显微镜下，以目镜中长度单位为0.24毫米的显微测微尺从耳蜗顶回向底回依次测量基底膜的长度并对逐个测微尺视野内的内外毛细胞进行计数，同时将计数结果输入到计算机与大鼠耳蜗图软件中的正常值进行比较，从而建立全耳蜗毛细胞损失百分比的曲线分析图。我们认为只有施行全耳蜗毛细胞计数并用耳蜗图才能从定位和定量两个方面真实反映全耳蜗各个不同部位毛细胞的损害程度[24-27].
采用和不脱钙取材法相同的解剖分离手法充分暴露前庭各个终器并分离取下两个囊斑及三个壶腹嵴，最后按类似不脱钙取材相同的方法修剪前庭终器周围的膜组织完成铺片和观察。许多药物造成的前庭毛细胞损害也表现出一个从囊斑微纹区向周边区扩展以及从壶腹嵴顶部向两侧扩展的病变模式[28,29],因此选自某一前庭终器的一张局部放大照片同样不能有效表达前庭各个终器不同部位感觉上皮细胞的病理学改变特征。我们主张在高倍光学显微镜下，以框定的一个小视野做为测量前庭毛细胞密度改变的定量观察指标。以球囊斑和椭圆囊斑铺片为例，以微纹区几个小视野测量数据的平均值来代表该微纹区的毛细胞密度，再以周边区几个小视野的平均毛细胞密度来反映周边区的毛细胞病变程度。我们认为只有用毛细胞密度的表达方式才能从定位和定量两个方面真实反映前庭各个终器不同部位毛细胞的损害程度[28-30].
3总结
掌握内耳膜迷路取材技术，是开展内耳病理学研究和组织化学研究以及分子生物学研究的必备手段，因为如果取不到内耳组织材料，上述研究都将无法进行。本文介绍了两种不同的大鼠内耳膜迷路取材方法，实际上无论是不脱钙取材还是脱钙后取材，都需要建立在对大鼠内耳解剖结构了如指掌的基础之上，对内耳结构的了解和熟悉显然离不开在解剖显微镜下的实际操作练习。本文在介绍内耳膜迷路解剖分离技术的同时，着重谈到显微镜下操作时每一步骤的具体操作方向、角度、力度及手法，我们希望这些来自实践的经验体会能为同道和初学者提供有益的技术帮助。本文还讨论了如何对耳蜗和前庭毛细胞病变进行定量分析的合理建议。
