摘要：目的：研究结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中EB病毒基因的表达。方法：筛选NK／T细胞淋巴瘤56例，应用手工显微切割进行组织纯化后，用PCR检测EBV的基因序列，并同时对相应组织用EBV抗体做免疫组织化学染色检查，对两种方法进行了比较。结果：56例NK／T细胞淋巴瘤应用手工显微切割进行组织纯化后，用PCR方法EBV阳性率为39／56(69.64％)，而用免疫组化方法阳性率为7／56(12.50％)，二者检出率有显著差异。结论：显微切割联合PCR技术能明显提高EB病毒检出率和准确性，是检测EBV的有效方法。
　　关键词：鼻NK／T细胞淋巴瘤；EB病毒；手工显微切割；聚合酶链反应
　　中图分类号：R373.9；R733.4　文献标识码：A　文章编号：1008－2409(2007)04－0678－03
　　
　　淋巴瘤是淋巴细胞单克隆增殖性疾病，由于瘤细胞的发生和发展重演了B、T细胞各阶段的发育，其形态学和遗传学改变表现出高度的异质性及组成成分的复杂性，成为困扰淋巴瘤诊断的主要原因。PCR检测淋巴细胞单克隆增殖性疾病失败的原因之一可能与送检标本中包含肿瘤细胞的多少，间杂坏死组织和多种炎症细胞背景有关。根据组织纯化的原理，在HE染色或亚甲蓝等染色下，用显微切割的方法直接分离出肿瘤细胞，再联合PCR技术，排除了非肿瘤细胞基因组DNA的影响．可以提高PCR检测阳性率和准确性。结外NK／T细胞淋巴瘤鼻型是2001年WHO正式命名的新的淋巴瘤亚型，亚洲多发，在中国特别是南部地区多发。本研究应用手工显微切割(hand－made microdissection)及聚合酶链反应(poly－merase chain reaction，PCR)技术检测结外NK／T细胞淋巴瘤(nasal NK／T－cell lymphoma，NKTCL)病变中EB病毒(Ep－stein Barr virus，EBV)基因的存在情况，并同时对相应组织用EBV抗体做免疫组织化学染色相比较。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1.1　材料来源
　　收集2001年1月至2006年3月桂林医学院及广西医科大学鼻部非霍奇金氏淋巴瘤外检病例，复习形态学、免疫组织化学(CD3e、CD45RO、CD20、CD56、GrB、LMP－1等)，根据2001年WHO关于淋巴造血组织肿瘤分类结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤诊断标准筛选，对形态学较符合但免疫组化不全或不符者重做免疫组化，共选出符合结外NK／T细胞淋巴瘤病例56例。选出鼻咽部慢性炎性组织20例做对照。
　　
　　1.2　研究方法
　　1.2.1 免疫组织化学方法 根据福州迈新生物技术开发公司推荐的免疫组化EliVisionTMplus法EBV抗体浓度为1:50。
　　阳性判定标准：以胞膜棕黄色和胞浆点状棕黄色为EBV阳性。用已知EBV阳性的霍奇金淋巴瘤(HD)作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组化阳性判断标准：肿瘤细胞阳性表达数≥10个／HP者，均视为阳性病例。阳性信号位于细胞膜，呈棕黄色。
　　1.2.2　显微切割①选取相应石蜡组织，按常规切取石蜡切片，连续切片，平铺于普通未涂胶的载玻片上，厚5μm②切片经常规的苏木精一伊红(Hematine－Eosine，HE)染色，不加盖载玻片；③用手工操作显微切割法：用手术刀片和9号注射针头配合应用，将切片放在显微镜载物台上，找到要切割的细胞，在低倍镜下，手持刀片在被切割细胞周围来回刻划，切挖直至与周围组织分离；用针头蘸少量粘合剂，渐渐接近被切割细胞，小心让其表面粘合剂与被切割细胞接触，由于二者粘合力较细胞与其下方的载玻片的粘合力大，抽回细针时，其尖端的细胞也随之被取出来，然后直接将细针连同其上粘附的细胞放入准备好的EP管中，继续其后的试验。
　　1.2.3 DNA提取和纯化①将提取物加入新鲜配制的PK缓冲液(10mmol／L Tris，HCI，pH8.0；1mmol／L EDTA，pH8.0；1％SDS)190μl+5／11蛋白酶K(20mg／L Protease K，PK)，70℃水浴1h。②追加10μl PK(20μg／μl)，置55℃温箱过夜。③加入等体积酚氯仿异戊醇溶液，混匀，13000rpm离心10min，取上层水相置另一离心管。④重复步骤3一次。⑤加入1／2体积醋酸铵+2.5倍体积无水乙醇，混匀，置－20℃过夜。⑥离心，13000rpm离心10min，倒弃液体。⑦加入75％乙醇，混匀，13000rpm离心10min，倒弃液体，晾干。⑧加入50μl双蒸水，溶解20min，置－20℃保存。核酸测定仪上测定DNA浓度及吸光度比值，A260／A280比值在1.60以下者弃用。
　　1.2.4 PCR 参考文献选取EBV特异性基因片段作为引物检测组织中EBV的表达，引物在基因库中经BLAST核对无误。EBV上游引物：5'-ACAATGCCTGTCCGTGCAAA-3'，EBV下游引物：5'-CTTCAGAAGAGACCTTCTCT-3'，片段大小为181bp。PCR反应条件：94℃ 50s，53℃50s，72℃1min，Thermal Cycler480DNA热循环仪上进行循环32次，72℃延伸10min。PCR反应体系为25μl，其中10×PCR buffer 2.5μl、2.5mmol／L dNTP 2μl、25mmol／L MgCl2 1.5μl、引物(10mmol／L)各1μl，DNA聚合酶0.2U，模板DNA 5μl，以ddH2O补足体积。采用Takara公司Taq酶。2％琼脂糖凝胶电泳，goldview染色，凝胶成像系统上观察结果并照相。条带为181bp左右。对照设置：以已知EBV阳性的鼻咽癌组织为阳性对照，已知阴性的鼻咽部炎性组织为阴性对照，dd H2O替代模板作空白对照。
　　
　　1.3　统计学方法
　　以SPSS10.0统计软件进行四格表资料的x。检验，以P<0.05判为差异有显著意义。
　　
　　2　结果
　　
　　2.1 PCR检测结果
　　56例中用PCR方法检测39例阳性(69.64％)，与鼻咽部慢性炎组织(2／20)相比有显著差异(见表1)。
　　

　　
　　2.2免疫组化检测结果
　　56例中用免疫组化检测EBV阳性者7例(12.5％)，与鼻咽部慢性炎组织(O／20)相比无显著差异(见表2)。
　　

　　
　　2.3 EBV两种检测方法比较
　　应用PCR方法与免疫组化方法相比较，结果有显著差异(见表3)。
　　

　　
　　3　讨论
　　
　　EBV检测有助于淋巴瘤增殖的不同诊断，探知治疗后疾病的残余和早期复发。PCR能利用新鲜组织，冷冻或石蜡组织，能检测已知的染色体异位，信捷职称论文写作发表网，应用范围广泛。但是EBV在免疫组化中表达文献报道常不一致(经常阴性或可变的)，如VanGorp J报道结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤EBV免疫组化检测阳性率为4／20(20％)，李百周、刘卫平以及万榕用免疫组化检测EBV阳性率分别为16.7％(2／12)、26.3％(5／19)、50％(10／20)。免疫组化中表达如此不一致，给病理诊断带来了严重干扰和困惑，不利于诊断的提高。赵莎等从蛋白和DNA水平上检测了67例结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤EBV的表达情况，并观察到EBV-DNA检出率明显高于蛋白的检出率，本试验与其基本相符。表达不一致的原因，可能由于肿瘤细胞在不同分化成熟阶段EBV蛋白表达水平不同，也可能由于EBV的转录和翻译水平受其它许多因素的影响，还可能与组织经过福尔马林处理、抗原修复困难等技术原因以及所选用抗体不同有关。因为免疫组化对EBV的检出率偏低，所以对于诊断没有很大的意义。而PCR方法能有效提高EBV的检出率和准确性，还可进一步进行基因分析和研究。如中国台湾地区研究22例鼻型NK／T细胞淋巴瘤，发现有14例表达LMP-1，并且表现为缺失30bp的基因型，认为基因缺失型LMP-1的高表达与台湾地区EBV相关的鼻型NK／T细胞淋巴瘤发病率较高有关。
　　我国人群中特别在南方地区EB病毒的感染率较高。目前研究认为鼻部NK／T细胞淋巴瘤EBV感染率很高，高达90％以上。LMP-1在离体实验中有细胞转换潜能，具有肿瘤基因产物的特征，诱导基因失调和形态学改变；诱导BCL一2基因产物的表达，阻止程序性细胞死亡，从而促进EB病毒感染细胞的永生化。研究发现LMP-1可使啮齿类动物的成纤维细胞转化并在裸鼠中成瘤，也可以引起一系列的细胞粘附因子(如ICAM-1、LFAl及LFA3等)和表皮生长因子受体(EpidermalGrowth Factor Receptor，EGFR)改变，有助于细胞的生长转化与转移浸润。LMP-1还可抑制细胞凋亡，主要与NF-kB通路，MAPK通路和JAK／sTAT通路等凋亡信号传导系统相关。因此，LMP-1是EB病毒致瘤的一个关键步骤。LMP-1在结外NK／T淋巴瘤中的表达证明EB病毒基因组可被转录和翻译为蛋白质，说明肿瘤细胞内的EB病毒不是一个“沉默的”过路者，而是致病的重要因素，LMP-1对该淋巴瘤的形成和发展起着重要的作用。尽管目前国内外报道在淋巴瘤病变中检出EB病毒DNA，提示EB病毒可能与淋巴瘤的发生有关，但由于阳性结果仅能说明细胞中有EB病毒DNA的整合，至于EB病毒在这些病变中究竟发挥什么作用，还有待于进一步研究。EB病毒感染在鼻NK／T细胞淋巴瘤发生及发展中的确切作用，是国内外同行关注的热点，已有研究发现其肿瘤组织中的EB病毒呈单克隆性，并认为EB病毒的克隆性增生发生在鼻NK／T细胞淋巴瘤发病前。根据组织纯化的原理，将成分复杂的淋巴瘤在HE染色或亚甲蓝等染色下，用显微切割的方法直接分离出肿瘤细胞，再联合PCR技术，排除了非肿瘤细胞基因组DNA的影响，提高了PCR检测阳性率和准确性。
　　
　　(本实验部分工作完成于广西医科大学病理学教研室，特此致谢!)
　　[责任编辑　高莉丽 邓德灵]