【关键词】 内皮细胞 创伤愈合 细胞骨架
Effects of microfilaments on the repair of endothelial monolayers wound
【Abstract】 Objective To observe the morphological changes of microfilaments，and to investigate the wound closure and cell proliferation after the disruption of microfilaments.Methods An in vitro wound model，immunofluorescence microscopy and 3H-TdR incorporation methods were used in this study.Results A specific and sequential changes in microfilaments occourred during wound healing. When the microfilaments were disrupted with cytochalasin B ，the wound closure and cell migration were greatly delayed.The endothelial cell 3H-TdR incorporation was also inhibited，which showed time and dose dependent relationship.Conclusion These results suggest that the microfilement system might be critical to wound healing， and the cytoskeletal system might directly or indirectly participate in the regulation of cell proliferation and wound healing.
【Key words】 endothelial cell wound healing cytoskeleton
创伤修复是一个复杂的生物学过程，许多因素参与了这一过程的调节。研究表明，细胞骨架系统（cytoskeleton system）不仅决定细胞的形态和运动，还参与控制细胞的生长、分化及细胞内外的信息传递［1］。因此在创伤修复过程中细胞骨架系统可能起着重要作用。微丝系统是细胞骨架的主要成分，本实验拟采用体外培养单层内皮细胞损伤模型，观察微丝在损伤修复过程中的相应变化，以及阻断微丝功能对损伤修复过程及细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及模型建立 参考文献的方法分离和培养人脐静脉内皮细胞［2］，以含20％FCS的DMEM（Gibco）液每2d换液1次。创伤模型的建立参考文献报道［3］，内皮细胞接种在含盖玻片的24孔培养板内，生长汇合成单层内皮细胞后，去除盖玻片中央1.5mm内皮细胞，制成创面。用装有网格测微计的倒置相差显微镜观测创面闭合速度，并计算某时刻创面闭合指数100×［1-(某时刻创缘间宽度/原始创缘间宽度）］。创缘间距离取３处不同点测量，重复３次，取平均数。
1.2 细胞处理 内皮细胞生长汇合成单层内皮细胞后，分为实验组和对照组，每组每种浓度复设12孔。实验组分别在损伤前1h各加入终浓度为0.2μg/ml、0.4μg /ml、0.8μg /ml和1.2μg /ml的细胞松弛素Ｂ（Sigma公司），对照组加等量的培养基。该药物于使用前用含20％FCS的DMEM配制，每2d换液1次并加相应浓度的细胞松弛素B。分别记录不同浓度药物作用下创面闭合速度和时间，以及不同时刻创面闭合指数。
1.3 微丝的荧光染色 分别于损伤前、损伤后不同时间取出培养板内的盖玻片进行染色。以4％多聚甲醛+TritonX-100固定10min，0.1M甘氨酸处理10min，加rhodamine-phalloidin（1∶20，Molecular Probes）染色40min，PBS冲洗3次×3min，加甘油/PBS（1∶1）封片，荧光显微镜观察、拍照。
1.4 3H-TdR掺入量测定 用含20％FCS的DMEM悬液以0.2×105/ml细胞密度接种于24孔板，培养至汇合，换成无血清DMEM培养24h后分为实验组和对照组，每组每种浓度复设12孔。实验组于损伤前1h每孔加浓度为1.2μg /ml的细胞松弛素Ｂ，而对照组于损伤前后不加药物，分别于损伤后8h、24h及48h收集样本。在收集样本前4h加1μci/孔的3H-TdR。自动液闪烁记录仪测定样本3H-TdR的每分钟脉冲数（CPM）。
1.5 统计学方法 数据以(x±s)表示，并对数据进行方差分析和t检验。
2 结果
2.1 单层内皮细胞损伤修复过程中细胞形态及微丝骨架的改变 内皮细胞接种至培养板后，4～5d生长汇合成单层内皮细胞，细胞呈典型的鹅卵石样外观，呈紧密连接，无重叠。此时微丝骨架主要分布在细胞膜下的致密周围带和核旁中央束，见图1。单层内皮损伤后3h左右，内皮细胞开始呈极性铺展，伸长并向创区迁移。此时致密周围带开始减少，微丝发生重排，大多朝向创缘呈极性排列，见图2。24h后致密周围带大部分消失，中央出现张力纤维。
图1 正常内皮细胞微丝分布荧光照片
图2 创缘内皮细胞微丝分布荧光照片
2.2 细胞松弛素Ｂ引起的微丝骨架改变及对创面闭合的影响 当以0.2μg/ml细胞松弛素Ｂ处理细胞时，可使致密周围带消失，中央束减少。此时内皮细胞向创区迁移明显被迟滞，平均速度为(13.1±4.1)μm/h，而对照组平均速度为(23.3±3.5)μm/h，明显慢于正常对照组（P<0.05，ｎ＝12）。随着细胞松弛素B浓度的增加，创面闭合速度也变慢，对创面闭合指数的影响呈时间—剂量依赖性，见图3。当以1.2μg/ml细胞松弛素B处理细胞时，微丝结构被破坏，并聚集成致密片状物。此时单层内皮细胞失去紧密鹅卵石样外观，出现细胞间隙，呈不规则扁平状。
图3 细胞松弛素B对创面闭合的时间—剂量依赖关系曲线
2.3 阻断微丝功能对内皮细胞3H-TdR掺入量的影响 损伤后8h，实验组内皮细胞的3H-TdR掺入量与对照组比较差异无显著性（P>0.05，n=12）。伤后24h及48h，内皮细胞的3H-TdR掺入量比伤后8h显著升高（P<0.05，n=12），而以细胞松弛素Ｂ处理的细胞则表现出明显的抑制作用，见图4，与对照组相比，差异有非常显著性（P<0.01，n=12）。
图4 阻断微丝功能对损伤单层内皮细胞3H-TdR掺入量的影响与对照组相比，*P＜0.05；
与损伤后8h相比(n=12)，**P＜0.05
3 讨论
创伤愈合过程是对损伤的一种含有多种细胞活动的有序反应。 内皮细胞是愈合的主要修复细胞， 内皮细胞的迁移、增殖及新血管形成是创伤愈合的基础， 许多因子均参与了这个过程的调节［1］。内皮细胞的许多功能都与细胞骨架有关或通过细胞骨架介导的［4］。细胞骨架与细胞质膜上的蛋白质分子相互连接而成为细胞形态支持、细胞间黏附、细胞运动和跨膜信息传递的基础。修复过程中，调节因子如细胞因子、炎性介质等可以通过诱导细胞骨架变化对内皮细胞功能进行调节，从而影响修复过程的调控。
本实验以单层内皮细胞损伤模型，研究了内皮细胞在修复过程中其微丝骨架的形态与结构变化，并观察阻断微丝功能对创面愈合及细胞增殖的影响。结果表明，内皮细胞的迁移、伸展和增殖伴随着微丝骨架特殊而有序的改变。伸展和迁移的内皮细胞中致密周围带明显减少，微丝发生重排，并朝向创缘方向排列。当以细胞松弛素Ｂ破坏微丝结构时，可不同程度地抑制创面闭合及细胞的增殖，并呈一定的时间—剂量依赖关系。提示：微丝功能在内皮细胞损伤修复过程中起重要作用，可能通过直接或间接效应影响DNA合成，参与修复过程的调节。
微丝系统的重要功能之一是为细胞间黏附，细胞与基质黏附以及各种细胞运动提供所需动力［5］，其动力来源于动力蛋白及ATP酶，并需Ca2+、Mg2+的参与。向创区移行、伸展的细胞致密周围带明显减少，可能为降低细胞间紧密连接和细胞间黏附，减少内皮细胞维持紧密单层细胞的能
