【摘要】 目的： 探讨检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者血液中TA，CEA mRNA，CK19 mRNA的临床意义，评价三者诊断NSCLC血液转移的应用价值. 方法： NSCLC组74例，非肿瘤性呼吸系统疾病患者(疾病对照组) 51例和健康人(健康对照组) 36例，信捷职称论文写作发表网，应用端粒末端重复序列扩增?杂交?酶联免疫检测技术检测TA，逆转录?套式?聚合酶链反应技术检测CEAmRNA和CK19 mRNA. 结果： NSCLC组血液TA，CEA mRNA和CK19 mRNA阳性率高于两个对照组(P<0.01)，且TA和CEA mRNA的特异性和敏感性也高于CK19 mRNA，但不同类型NSCLC检测3个指标结果的差异无统计学意义(P>0.05). 结论： 检测血液TA，CEA mRNA和CK19 mRNA有助于发现NSCLC细胞血液转移，且TA和CEA mRNA的价值高于CK19 mRNA，但此3个指标可能无助于鉴别NSCLC的类型.
【关键词】 癌 非小细胞肺 血液 端粒 末端转移 酶癌胚抗原 角蛋白 RNA 信使
0引言
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的70%以上，约50%多的NSCLC患者在最初诊断时已有远处转移，预后较差. 肺癌微转移是肺癌的恶性标志和主要特征之一，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因. 因此，明确肿瘤有无转移，对治疗决策的制订、预后评估等具有重要的指导意义，早期诊断和治疗肺癌微转移是提高肺癌治疗率、改善患者预后的有效途径. 至今，对NSCLC早期转移、微转移、血行转移等的诊断仍没有令人满意的方法. 研究提示，检测血液中端粒酶活性(TA)和癌胚抗原信使核糖核酸(CEA mRNA)指标对了解NSCLC血液转移有较大帮助，且作用优于CK19 mRNA.
1对象和方法
1.1对象我院住院NSCLC患者74（男47，女27）例，年龄37～75岁，其中腺癌24例，鳞癌22例，腺鳞癌14例，大细胞肺癌14例. 非癌性肺部疾病患者(疾病对照组)51（男29，女22）例，年龄16～76岁，包括间质性肺炎9例，支气管扩张9例，肺结核11例，肺囊肿11例，炎性假瘤11例. 均经手术或穿刺活检病理证实诊断. 健康志愿者(健康对照组)36（男20，女16）例，年龄18～75岁. 对肿瘤患者及检测指标阳性者通过通信、电话形式进行随访0.5～3 a. 应用柠檬酸钠抗凝剂真空采血管采集静脉血液，分离、提取有核细胞，预冷生理盐水充分洗涤有核细胞，以备检测TA，CEA mRNA及CK19 mRNA. 如不能即时检测，应尽快提取血液有核细胞，分装后封存于-70℃.
1.2方法应用端粒末端重复序列扩增?杂交?酶联免疫检测技术(TRAP?Hyb?ELISA)检测TA，试剂盒为华美生物工程公司商品试剂盒. 检测操作经过端粒酶催化端粒末端重复序列复制、PCR扩增、扩增产物微孔板杂交、酶联免疫测定等步骤，于450 nm波长测定各反应孔A值，以检测孔A值>2.0倍阴性对照孔A值为端粒酶阳性结果. 应用逆转录?套式?聚合酶链反应技术(RT?NP?PCR)检测CEA mRNA和CK19 mRNA，CEA mRNA检测试剂盒为上海复星生物技术有限公司的商品试剂盒，CK19 mRNA检测试剂盒由北京美迪科生物科技有限公司提供. 操作经RNA模板提取、逆转录合成cDNA、套式PCR扩增、扩增产物琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色、紫外检测等步骤，以出现与试剂盒提供的阳性对照同齐的核酸电泳亮带为阳性结果. 实验按试剂盒操作说明书进行.
统计学处理：组间比较应用χ2检验，同组内两种检测结果比较应用配对χ2检验法.
2结果
2.1外周血TA，CEA mRNA 和CK19 mRNA变化在疾病对照组，2例TA阳性结果分别来自肺结核和炎性假瘤；CEA mRNA阳性结果分别为肺结核2例，炎性假瘤1例；CK19 mRNA的阳性结果为肺结核2例，炎性假瘤2例，肺囊肿2例，间质性肺炎1例. 健康对照组的2例CK19 mRNA阳性者，未见任何有意义的检查及既往发现，其中，1例于1，3，6，12 mo后的4次复查均呈阴性结果，另1例于1，3，6，12 mo后的4次复查中有1次(3 mo后)呈阳性结果，其余均阴性. NSCLC组的各结果与两个对照组比较，差别均有统计学意义(TA，CEA mRNA和CK19 mRNA，与疾病对照组比较χ2=44.218，42.789和8.345；与健康对照组比较χ2=38.834，40.348和11.925， P<0.01). 在NSCLC组内，TA与CEA mRNA的差别无统计学意义(χ2=0，P>0.05)，双阳性的有42例； TA与CK19 mRNA的差别有统计学意义(χ2=12.960，P<0.01)，双阳性的有26例；CEA mRNA与CK19 mRNA的差别有统计学意义(χ2=16.409，P<0.01，表1)，双阳性的有28例. TA与CEA mRNA，TA与CK19 mRNA， CEA mRNA与CK19 mRNA及3个指标联合检测的总体特异性和敏感性分别为96.6%和74.3%，89.7%和68.9%，88.5%和67.6%及88.5%和75.7%. 在74例NSCLC患者中，有6例(8.1%)于无临床肺癌证据之前的0.5~4 mo被检测出外周血TA或/和CEA mRNA呈阳性结果. 表1外周血TA，CEA mRNA，CK19 mRNA阳性结果
2.2不同类型NSCLC患者外周血TA，CEA mRNA，CK19 mRNA变化不同类型NSCLC的结果差别，均无统计学意义(P>0.05). 在腺癌组内，TA与CEA mRNA, TA与CK19 mRNA, CEA mRNA与CK19 mRNA两两之间的差别均无统计学意义 (χ2=0，2.500，2.286；P>0.05)；在鳞癌组内，TA与CEA mRNA 的差别无统计学意义(χ2=0，P>0.05)，TA与CK19 mRNA, CEA mRNA与CK19 mRNA的差别有统计学意义 (χ2=5.143，4.900，P<0.05)；在腺鳞癌组内，TA与CEA mRNA, TA与CK19 mRNA, CEA mRNA与CK19 mRNA两两之间的差别均无统计学意义 (χ2=0，1.333，2.250, P>0.05)；在大细胞癌组内，TA与CEA mRNA, TA与CK19 mRNA, CEA mRNA与CK19 mRNA两两之间的差别均无统计学意义(χ2=0，1.333，0.800，P>0.05).
3讨论
细胞永生化与TA密切相关，TA增高被认为是肿瘤细胞的生物学特征之一［1-2］； CEA是一种特异性较高的肿瘤相关抗原，作为CEA基因的表达产物CEA mRNA几乎能在所有上皮起源的癌细胞中高水平表达［3］；CK是上皮细胞中间丝的成分蛋白，是上皮分化的可靠标记物，作为CK基因的表达产物CK19 mRNA在各种上皮和上皮起源的恶性肿瘤中均可有表达，外周血中不见表达［3-4］. 外周血循环中肿瘤细胞数量非常少，要求检测方法具有高度的灵敏度和特异度，由经典PCR技术发展形成的RT?NP?PCR和TRAP?Hyb? ELISA在分析微量核酸物质方面具有更高的特异度和灵敏度，能在106～107个正常细胞中检出一个肿瘤细胞，明显优于传统的细胞形态学、免疫组织化学、细胞遗传学、流式细胞仪等技术，是理想的检测肿瘤细胞的方法之一［3］. 我们研究表明，NSCLC患者外周血TA，CEA mRNA和CK19 mRNA的检出率高于肺良性病变组、健康对照组(P<0.01)，提示TA，CEA mRNA和CK19 mRNA对外周血循环的NSCLC细胞具有很高的特异性和较好的敏感性，可以用作检测NSCLC细胞血液转移的指标，其中TA和CEA mRNA的特异性和敏感性均优于CK19 mRNA，尤其在无其他临床发现前可能较CK19 mRNA更敏感；联合检测与单项检测相比，能在不明显损害特异性的情况下明显提高敏感性，其中以TA＋CEA mRNA最理想，是检测NSCLC患者外周血肿瘤细胞的有价值的一种组合方法. 在不同类型NSCLC患者外周血中，TA或CEA mRNA或CK19 mRNA的结果虽然有所不同，但差别均无统计学意义(P>0.05). 在疾病对照组和/或健康对照组中存在一定的阳性结果，尤其是CK19 mRNA，其原因可能有血细胞中假基因的扩增［2］或某些再生幼稚细胞或癌前变异细胞的目的基因表达以及非上皮细胞的低水平表达或RNA提取过程中DNA 的污染或操作过程中样本间相互污染及抽血时皮肤上皮细胞的污染等原因，此外尚不能完全排除对照组对象存在其他亚临床恶性肿瘤的可能，需注意密切随访.
外周血中检测出TA, CEA mRNA和CK19 mRNA的阳性表达提示循环中存在肿瘤细胞，其意义一般认为是增加了转移的风险而并非一定形成临床转移灶. 随着长期随访资料的增多，循环中肿瘤细胞检测的临床价值将得到进一步证实. 研究提示，NSCLC患者发生肿瘤细胞血行转移的情况较多，检测外周血TA和CEA mRNA是监测NSCLC细胞血液转移的良好指标，其特异性和敏感性均优于CK19 mRNA，联合应用TA和CEA mRNA可进一步提高检出率.
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