作者：高柳村，陈彩云，周鹏，陈景藻，舒青

【关键词】  次声；小鼠；睾丸细胞；甲基化

     【Abstract】 AIM: To investigate the changes of genome DNA methylation of testicular cells in mice with high performance liquid chromatography (HPLC) after infrasound exposure, and to explore the relations between infrasound and epigenetics.  METHODS: The BALB/c mice were exposed to infrasound (8 Hz/130 dB) for 1, 7 and 14 d, respectively, 2 h daily, and the control groups were unexposed. Then the changes of genome DNA methylation of testicular cells in the mice were analyzed with HPLC. RESULTS: The levels of the genome DNA methylation of testicular cell in exposed groups were all significantly lower than those in control groups as time went on (1 d, 0.0150±0.0127 vs 0.0235±0.0062; 7 d, 0.0140±0.0030 vs 0.0273±0.0040; 14 d, 0.0150±0.0096 vs 0.0250±0.0049. P=0.000). CONCLUSION:  The infrasound markedly affects the genome DNA methylation of testicular cells. These changes are positively associated with the infrasound exposure time.

    【Keywords】 infrasound; mice; testis cell; methylation

    【摘要】 目的： 应用高效液相色谱分析技术对次声作用后小鼠睾丸细胞基因组DNA CpG甲基化的变化进行分析，以研究次声作用与表遗传学改变的关系. 方法： 采用8 Hz, 130 dB的次声分别作用于1, 7和14 d组3个实验组,各雄性Balb/c小鼠20只，每日次声暴露2 h. 同时设对照组，并利用高效液相色谱分析技术对实验组与对照组的小鼠睾丸细胞基因组DNA CpG甲基化水平进行检测. 结果： 次声暴露1, 7和14 d组的小鼠睾丸细胞基因组DNA CpG甲基化程度均低于对照组，并随次声作用时间的变化而改变，分别为0.0150±0.0127 vs 0.0235±0.0062, 0.0140±0.0030 vs 0.0273±0.0040, 0.0150±0.0096 vs 0.0250±0.0049 （P=0.000）. 结论： 次声作用可致睾丸细胞基因组DNA CpG甲基化的改变，与次声暴露时间有关.

    【关键词】 次声；小鼠；睾丸细胞；甲基化

      0引言

    高强度次声可致生物体组织和器官的损伤，可使日常生活和战斗能力受到影响. 表遗传学是研究没有DNA序列变化、可遗传的、稳定的基因表达（修饰）的改变. 次声是否可致生殖细胞表遗传学变化尚未见报道. 本实验我们采用第四军医大学研制的次声压力舱系统，观察在一定声压级水平的次声作用下小鼠睾丸细胞基因组DNA CpG甲基化的变化情况，以研究次声的损伤与表遗传学改变的关系，为探讨次声对人体的危害及制定预防措施提供一定的依据.

    1材料和方法

    1.1仪器设备次声声源及检测系统采用第四军医大学在中国科学院声学研究所和航天工业总公司第41所的指导和协作下建成的、声源为电动扬声器式次声压力舱系统及检测系统. 次声压力舱系统由低频信号发生器、功率放大器和电动扬声器组成. 检测系统主要包括次声传声器和次声信号数据采集分析系统.

    1.2实验动物及分组健康雄性Balb/c小鼠90只(体质量18～20 g)，我校实验动物中心提供. 分笼饲养于安静舒适的环境下(基础噪音不高于40 dB)，标准饲料喂养，自由饮水. 小鼠随机分为1, 7和14 d共3组，每组20只，每天暴露于次声压力舱产生的8 Hz, 130 dB声压场中2 h；对照组每组10只，按上述3个时间点每天在次声舱内无作用放置2 h.

    1.3睾丸组织DNA提取与鉴定各组于次声作用完毕后当日用脊椎脱臼法处死小鼠. 摘取睾丸组织，将1.0 g组织放入研钵中磨碎，加DNA提取液10 mL（含10 mL/L Tris Cl pH 8.0, 0.1 mol/L EDTA, pH 8.0, 0.5 g/L SDS），蛋白酶K消化，55℃水浴过夜，饱和酚/氯仿法抽取DNA，冰乙醇沉淀DNA，常温晾干，加水溶解，紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度.

    1.4HPLC基因组甲基化检测将100 μg基因组DNA和100 μL 400 mL/L的氢氟酸(HF，优级纯，上海致冷剂厂)混匀，80℃温育12 h后开盖置40℃烘箱至液相完全蒸发，随之加新鲜配制的0.02 mo1/L pH为2.3的NH4H2P04 100 μL. 碱基水解后，采用包括自动紫外监测及积分仪的Waters 510型HPLC，按要求进行检测. 积分面积5 mC/(5 mC十C)的百分数检测总基因组DNA中5mC的含量即DNA甲基化的水平［1］. 检测开始前分别用A，T，G，C与5mC的标准品过柱［2］，确定5 mC与C峰值出现的时间.

    统计学处理：数据用x±s表示,采用SPSS12.0统计软件分析. 1, 7和14 d暴露组与对照组组间用方差分析. P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    次声作用1, 7和14 d后各暴露组与相应对照组比较DNA甲基化均有不同程度的降低，并随次声作用时间的增加而改变. 次声作用使暴露组与对照组之间DNA甲基化的程度差异有统计学意义（P=0.000），而各组间DNA甲基化的程度差异不明显（P=0.269，表1）.表18 Hz/130 dB次声暴露后小鼠睾丸细胞DNA CpG甲基化水平的变化（略）

    3讨论

    次声超过一定声压级水平的次声暴露可造成生物体器官或细胞功能及形态的损伤［3］，当声压频率为16 Hz声强为100 dB次声作用能引起淋巴导管的收缩反应［4］. 声压频率为16 Hz声强为130 dB的次声暴露可诱使L929细胞细胞膜上突起缩短凹陷变浅［5］，引起内皮细胞损伤［6］和心肌细胞凋亡［7］. 声压频率为8 Hz声强为130 dB次声暴露可使大鼠海马5HT, 5HTR, RyR表达减少［8］，造成神经细胞损伤和功能紊乱，进而引起动物学习记忆功能障碍. 同等声压级水平的次声暴露还可导致小鼠生育能力降低［9］，次声暴露强度≥130 dB可引起豚鼠Corti器超微结构不同程度的损伤和听阈永久性丧失［10］.

    魏亚宁等［11］报道次声暴露对小鼠睾丸组织细胞及其超微结构的影响，损伤以次声参数为8 Hz/130 dB最为严重，在7和14 d组中出现了大量的畸形精子. 我们实验选取能使小鼠睾丸支持细胞、间质细胞及生精细胞损伤现象最为严重的8 Hz/130 dB次声作用小鼠，信捷职称论文写作发表网，并观察在该声压级水平的次声条件下，暴露不同时间后小鼠睾丸细胞基因组DNA甲基化的变化情况. 结果表明小鼠睾丸细胞基因组DNA甲基化的水平与次声的暴露与否密切相关，并随暴露时间的增加而改变. 这种甲基化的调节过程出现在机体应激损伤修复的早期阶段，低甲基化可能易于发生各种修复基因的转录翻译，进而增强表达功能性蛋白，通过此种方式以加强睾丸细胞对抗外界次声损伤的能力，随后小鼠睾丸组织对次声作用产生适应性. 结果提示次声作用与基因组DNA甲基化的水平具有正态的量效关系. 由本实验推测低甲基化可作为次声导致睾丸组织细胞损伤的早期检测指标之一，对次声损伤及其严重程度的评价具有较重要的诊断提示价值，但次声共振反应后的睾丸细胞甲基化水平的普遍降低值得进一步研究.

    【参考文献】

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    ［7］ 幺晓轶,裴兆辉,朱妙章，等. 8 Hz/90 dB次声暴露后心肌细胞凋亡及其相关机制研究［J］. 第四军医大学学报,2006,27(6):490-492.

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    ［9］ 刘秀敏，甄荣，陈惠芳，等. 次声对小鼠生育能力与免疫功能的影响［J］. 中华物理医学与康复,2000,22(2):100-103.

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    ［11］ 魏亚宁，刘静，舒青，等. 次声暴露对小鼠睾丸细胞超微结构的影响［J］. 中华男科学,2002,8(5):323-328.