氨基端肽及p53羧基端肽在体外对人的肿瘤细胞均有明显抑制作用［3］，但它们的抗肿瘤机制不同. p53氨基端肽形成的S螺旋结构，可直接导致肿瘤细胞坏死［4］；来自p53核心区的结构肽，可以稳定p53的结构和恢复变异p53诱导肿瘤细胞凋亡的功能. p53羧基端肽任意的盘绕结构能够穿过细胞膜，捆绑在细胞内的靶目标上，引起细胞凋亡，它是选择性地诱导细胞死亡，对正常细胞或非肿瘤细胞没有毒性，并且对p53变异型的肿瘤细胞作用更强，尤其是当p53羧基端肽和膜渗透肽嵌合后可以有效增强抗肿瘤作用［5］. p53羧基端肽的抗肿瘤作用是p53依赖性的，它是通过FADD/caspase8途径特异的导介肿瘤细胞的凋亡［6-8］，故通过转导p53羧基端肽挽救p53的功能是一种新的方法. 然而只利用生物短肽治疗肿瘤，由于肽容易被降解需要反复多次注射，在体内的半衰期较短，水溶性、稳定性差，生物利用度低，信捷职称论文写作发表网，对在体肿瘤不能达到有效浓度剂量.
 
　　细胞穿膜肽可有效将多肽、蛋白质分子及DNA片段，通过无受体介导、无耗能的方式，导入多种哺乳动物细胞，并且细胞膜亲和性高，穿膜速度快，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤［9］. 穿膜肽可有效将目的基因片段导入细胞内［10］，有望解决目前运用病毒载体进行基因治疗时，转染效率低的主要问题，具有较高的临床治疗价值，已应用于肿瘤细胞系、动物移植瘤的治疗，为此我们在表达盒中设计了Ant穿膜肽［11］. 基因转移载体的设计是基因治疗研究中的一个关键，理想的体内基因转移载体应用有较好的细胞靶向性、目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行，以往在基因治疗的研究中，逆转录病毒，腺病毒等载体应用较多. 随着研究的深入，人们发现上述载体由于自身的某些缺陷不能满足研究与治疗的需要. AAV载体则避免了上述载体的缺陷，是近年来使用的转导效率高的病毒载体，提高了转导效率，并能感染分裂和非分裂细胞，适合肿瘤基因治疗［12］. 为此本课题成功地将回收的嵌合NT4p53(C22)Ant cDNA片段亚克隆于腺伴随病毒穿梭质粒pSSHGCMV中，构建了重组质粒pSSHGCMVNT4p53(C22)Ant. 应用斑点杂交试验检测重组病毒AAVNT4p53(C22)Ant的滴度为2×1010/mL. 为了提高腺伴病毒载体的转导效率，我们用了神经营养因子(NT4)信号肽，引导肽与目的短肽相连接.
 
　　我们发现，AAVNT4p53(C22)可导致肿瘤形态变异，数目减少，证明了AAVNT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对胰腺癌细胞系MiapacaⅡ的杀伤作用；PI流式细胞检测发现治疗组细胞凋亡较对照组增多；LDH检测结果显示随着AAVNT4p53(C22)对MiapacaⅡ转染时间的增加，培养基中LDH逐渐增加，但与空病毒组与未处理组间无差异. LDH测定是检测细胞坏死情况的指标，表明重组病毒对细胞的杀伤作用不是引起细胞坏死，而是细胞的凋亡，这同流式细胞仪检测的结果一致. 再次证实了AAVNT4p53(C22)Ant对胰腺癌细胞MiapacaⅡ有杀伤作用，并且是通过引起细胞凋亡而实现的.

　　【参考文献】

　　［1］ Bykov VJ, Issaeva N, Shilov A, et al. Restoration of the tumor suppressor function to mutant p53 by a lowmolecularweight compound ［J］. Nat Med, 2002,8(3):282-288.

　　［2］ Winter M, Milne D, Dias S, et al. Protein kinase CK1delta phosphorylates key sites in the acidic domain of murine doubleminute clone 2 protein (MDM2) that regulate p53 turnover ［J］. Biochemistry, 2004,43(51):16356-16364.

　　［3］ Saleh J, KreisslerHaag D, Montenarh M. p53 autoantibodies from patients with colorectal cancer recognize common epitopes in the N or Cterminus of p53 ［J］. Int J Oncol, 2004,25(4):1149-1155.

　　［4］ Rosal R, BrandtRauf P, Pincus MR, et al. The role of alphahelical structure in p53 peptides as a determinant for their mechanism of cell death: necrosis versus apoptosis ［J］. Adv Drug Deliv Rev, 2005,57(4):653-660.

　　［5］  Li Y,  Rosal RV, BrandtRauf  PW, et al. Correlation between hydrophobic properties and efficiency of carriermediated membrane transduction and apoptosis of a p53 Cterminal peptide ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2002,298(3):439-449.

　　［6］ Falke D, Fisher MH, Juliano RL. Selective transcription of p53 target genes by zinc fingerp53 DNA binding domain chimeras ［J］. Biochim Biophys Acta, 2004,1681(1):15-27.

　　［7］ Teruya K, Murphy AC, Burlin T, et al. Fmocbased chemical synthesis and selective binding to supercoiled DNA of the p53 Cterminal segment and its phosphorylated and acetylated derivatives ［J］. J Pept Sci, 2004,10(8):479-493.

　　［8］ Schwarze SR, Ho A, VoceroAkbani A, et al. Invivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse ［J］. Science, 1999,285(3):1569-1572.

　　［9］ Lindgren ME, Hallbrink MM, Elmquist AM, et al. Passage of cellpenetrating peptides across a human epithelial cell layer in vitro ［J］. Biochem J, 2004,377(1):69-76.

　　［10］ Gratton JP, Yu J, Griffith JW, et al. Cellpermeable peptides improve cellular uptake and therapeutic gene delivery of replicationdeficient viruses in cells and in vivo ［J］. Nat Med, 2003,9(3):357-362.

　　［11］ Yomoki S, Shiroh F, Miki N, et al. Possible existense of common internalization mechanisms among argininerich peptides ［J］. J Biochem, 2002,277(4):2437-2443.

　　［12］ Gao G. Adenoassociated viruses undergo substantial evulution in primates during natural infections ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(10):6081-6086.