关键词： 恶性疟原虫；Plasmodium falciparum P.f；基因转染；病原生物 

　　随着恶性疟原虫（Plasmodium falciparum,P.f）2号[1]、9号[2]和3号[3]染色体序列的相继明了，关于P.f基因组的研究大大向前迈进了一步，在未来的2～3年内，将有可能对其全部基因组序列分析完毕。毫无疑问，疟原虫研究即将或已经进入后基因组时代[4]。对疟原虫各种基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗和抗疟药物作用靶位的必要前提，但许多基因的功能，尤其是与疟原虫致病力有关的重要基因的功能尚未得以阐明，因而影响了疟疾的防治工作。以往的基因功能研究局限于与已知功能基因的比较和间接地推测，近年来发展的疟原虫基因转染技术[5]可通过改变基因后观察表型变化在活体研究基因的功能，使疟原虫基因的研究现状大为改观。不仅如此，该技术也使疟原虫基因表达调控、药物抗性研究、细胞生物学以及疫苗的研究均出现了崭新的技术性变化。在四种感染人的疟原虫中，P.f的致病性最为严重，其研究历来倍受重视，本文就疟原虫（主要是P.f）基因转染方面的研究作一综述。
　　1　疟原虫基因转染的种类
　　1.1短暂转染
　　自70年代末Hinnen等[6]建立酵母转染技术以来，真核细胞的转基因技术在基因调控和基因功能的研究中起到了极其重要的作用。1993年Goonewardence等[7]首先进行了疟原虫基因转染开创性的工作，为疟原虫基因转染技术的不断发展和广泛应用奠定了基础。作者将虫荧光素酶（firefly luciferase）基因插入鸡疟原虫（Plasmodium gallinaceum,P.g）有性期基因pgs28的编码区，构成嵌合基因后克隆入质粒载体pUC13，以电穿孔法导入P.g的雌配子和受精的合子，信捷职称论文写作发表网，24小时后检测到虫荧光素酶的短暂表达。两年后，Wu等[8]报导了P.f环状体的短暂转染。将外源氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）基因分别置于P.f 热休克蛋白86（heat shock protein 86,HSP86）的5’和3’侧翼序列，或富组氨酸蛋白3（histidine-rich protein 3,HRP3）的5’侧翼序列和HRP2的3’侧翼序列等基因调控序列的控制下，也检测到外源CAT在P.f的短暂表达。
　　短暂转染常用于基因调控的快速分析，通过报告基因的转录表达即可分析调控基因在基因表达调控中的确切作用。但在很多方面的研究和应用中稳定转染是必需的。
　　1.2 稳定转染
　　与短暂转染不同，稳定转染（或转化）后将由于外源DNA的表达导致细胞表型的永久改变。
　　1.2.1 附加体型的稳定转染
　　一般而言，以环状质粒进行转染主要导致附加体的自我复制。在有药物作用时，环状质粒可以附加体的形式稳定存在（若延长给予高浓度药物作用，部分质粒可与受体细胞基因组整合）；当去除药物作用时，附加体将由于随机分离而不稳定，并在细胞分裂中丢失[9～12]。所以，这种“稳定”是相对的、有条件的。
　　van Dijk等[11]转染伯氏疟原虫（Plasmodium berghei,P.b）裂殖子时发现，在药物作用下质粒在受体细胞内以环状、非重组型附加体进行复制，虽然每个细胞中质粒拷贝数可高达15个，但未发现质粒与基因组的整合。
　　1.2.2 整合型的稳定转染
　　在van Dijk等转染P.b之后，Wu、Crabb、Vanderwel等分别对P.f和P.k进行转染，均得到了稳定的整合型转染子[10、12、13]。尤其在1997年，Crabb等[14]构建了一系列具有CAT基因和鼠弓形虫(Toxoplasma gondii,T.g)的二氢叶酸还原酶胸苷合成酶(dihydrofolate reducease-thymidylate synthase, DHFR-TS)双功能基因的变异体[乙胺嘧啶(pyrimethamine,pyr)抗性相关酶]、但定位方式不同的质粒载体，转染P.f环状体再以pyr筛选以获得稳定的转染子，并系统地分析了不同的启动序列和终止序列对外源基因表达的影响，使疟原虫稳定转染技术趋于成熟，为进一步研究疟原虫生物学特别是基因功能打下了坚实的基础。
　　2 疟原虫基因转染的方法学
　　2.2.1 疟原虫转染载体的主要构件
　　 用于疟原虫转染的载体根据不同的用途包含的构件有所差异，其中主要的有调控序列、报告基因和筛选标记。
　　基因转染中阳性转染子的筛选依赖于载体中选择基因的表达，而选择基因的表达又依赖于其侧翼区的调控序列。在疟原虫的基因转染中，该调控序列可以是同（种）源或异（种）源的，包括5’区和3’区，前者提供启动子和5’非翻译区(untranslated region，UTR），后者提供3’UTR和转录终止信号。用于P.f的调控序列有：CAM的5’和3’、Pf DHFR-TSR 的5’、P.chabaudi的DHFR-TSR 5’、HSP86的5’、HRP3 的5’、P.f增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的5’和HRP2 的3’ [12]。
　　van der Wel等[13]采用完全异源的调控序列（源于P.f或P.b的启动子）和筛选基因（T.gDHFR-TSR或P.b DHFR-TSR）构建的载体转染P.k获得成功，表明这三个疟原虫种具有共同的基因表达调控信号。
　　报告基因的表达产物，往往具有便于测定的酶活性、直接或间接荧光等特性。通过对其产物活性的测定可以推知报告基因的表达强度，进而对表达调控的某种（些）因素获得一定的认识。好的报告基因应具有方便、可靠、敏感、线性、简单和动态等几个特点。目前应用于疟原虫转染的报告基因有：虫荧光素酶[7]、CAT[8]、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)[14～17]，其中后两者已在P.f表达成功。CAT的活性需要14C氯霉素或3H乙酰辅酶A和液闪计数仪进行定量，但对于大多数研究者而言，废弃同位素的处理受到严格的限制。虽然已经出现了CAT的荧光分析，但尚未得到普遍应用。最近发现GFP可以作为真核细胞报告基因[18]，因其众多的优点（不加任何底物紫外线激发后就能产生荧光，荧光性质稳定，分子量小，对细胞没有毒性，使用方便，可进行活细胞实时定位观察）而被称为“活细胞的分子探针”[19]（也可利用GFP的荧光特性通过流式细胞仪筛选阳性转染子），在生命科学研究中得到了广泛的应用，是研究活细胞生命现象的新途径。
　　目前在疟原虫转染中DHFR-TSR是最常用的也是最好用的抗性筛选基因，它可置于各种同源或异源调控序列下进行表达[20]。DHFR-TSR可以是源于疟原虫的，也可以是源于T.g的，而一般后者作为筛选基因更好，因为它不但可减少与内源DHFR-TS的重组机率，而且可赋予转化子较高的pyr抗性。体外研究表明，含T.gDHFR-TSR的P.b转化子与含P.bDHFR-TSR的P.b转化子相比，前者对pyr的抗性水平比后者高10～100倍。当两种共转染入P.k后，含T.gDHFR-TSR的转化子在体内优先被选择[9、13、20]。
　　最近，Mamoun等[21]报导了两个可用于P.f转染的新的筛选基因：bsd和neo。前者编码土曲霉的blasticidin s 脱氨酶，对blasticidin S具抗性；后者编码转座元Tn5的新霉素磷酸转移酶Ⅱ，对geneticin即G418有抗性。但一些容易引起抗药性的药物则不能用于药物选择。
　　2.2 转染方法
　　目前在所有疟原虫的转染中主要采用电穿孔法。其原理是在高电压电场的作用下，细胞表面会形成临时性的微孔，外面的DNA分子即可进入细胞。所以，电穿孔技术实际上是一种物理学手段，而不是生物化学技术。不同种的疟原虫在电转染时的条件有所不同，P.f的转染条件为：2.5kV，25μF，200Ω，4mm电转杯（Bio-Rad） [8、9]，或0.31 kV，960μF，0.2mm电转杯[22]。
　　2.3 转染效率
　　VanWye等[23]根据其P.f的转染实验首先估计疟原虫电穿孔法短暂转染的效率为10-2数量级，且可有10倍左右变化。曾有P.f1%的转染率，但在大多数实验室仅为10-6。与P.f相比，弓形虫（Toxoplasma）的转染率较高，可达存活虫数的5%。利什曼原虫（Leishmania）的转染率也仅为10-4。 dan Goldberg使用SuperfectTM (Qiagen)使P.f的短暂转染