mitoKATP通道开放对离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用
作者：佚名； 更新时间：2014-12-13
【摘要】 目的 观察不同类型ATP敏感性钾通道开放对高钾停跳离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨可能的保护机制。方法 采用离体兔心Langendorff灌注实验模型，离体兔心40只随机等分成五组（n=8）：对照组（C组）、Pinacidil组（P组）、Diazoxide组（D组）、5-HD+Pinacidil组（HP组）、5-HD+Diazoxide组（HD组）。离体兔心4℃标准St.Thomas停搏液（K+16mmol/L）至心脏停跳，45min后再灌注20min，药物于心脏停跳前灌注15min。对比观察Pinacidil、Diazoxide及其与5-HD合用时心脏的功能指标、冠脉血流量以及再灌注末心肌组织中腺苷酸含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD) 活性和心肌酶的变化。结果 P组、D组、HP组再灌注后复跳时间、心功能的恢复率、心肌能量保存、SOD活性均显著高于C组，心肌酶、MDA的含量显著低于C组，HP组心功能的恢复、能量保存差于P组，心肌酶、MDA的含量高于P组。结论 肌纤维膜型(sarcKATP通道)和线粒体型(mitoKATP通道) KATP通道共同参与对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，其中mitoKATP通道起主导作用。
【关键词】 mitoKATP通道；缺血再灌注损伤；离体家兔；心脏
【Abstract】 Objective To investigate the protective effects of different ATP-sensitive potassium (KATP) channel opens， Pinacidil and Diazoxide ，on myocardium injury in isolated rabbit hearts caused by ischemia/reperfusion and possible changes after application of ATP-sensitive potassium channel blocker，5-HD. Methods Observation was made on rabbit hearts perfused with a Langendorff apparatus. 40 rabbits were randomly divided into four selected groups：1. Pinacidil；2. Diazoxide；3. 5-HD+Pinacidil；4. 5-HD+Diazoxide. All groups were subjected to 40 minutes occlusion， then followed by 20 minutes reperfusion as cardiac stopped functioning by cold cardioplegia. Any one of Pinacidil，Diazoxide ，Pinacidil or Diazoxide mixed with 5-HD was infused 15 minutes before cardioplegic heart rested in experimental group.Hemodynamics variables，levels of adenine nucleotides and lipid peroxide of the myocardium were measured. Results (1)In Group P， Group D and Group HP， the recovery of myocardial contractility and heart rate were faster and MDA level of myocardium and had much lower levels of activities of cretinkinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH). Moreover levels of myocardial adenosine triphosphate (ATP)（P＜0.05 or 0.01）were much higher.(2)In Group HP， however， the recovery of myocardial contractility and heart rate could not be as good as Group P， MDA level of myocardium and release amount of albumen was higher than P group. Conclusion The ATP-sensitive potassium channel openes may enhance myocardial protection against ischmia /reperfusion injury. The above effect of myocardial protection was only partially closed down by ATP-sensitive potassium channel blocker： 5-HD. These results shows that selective pharmacological agents implicate mitochondria and sarcolemmal KATP channels are not important in ischemic cardioprotection.
【Key words】 mitochondrial ATP sensitive potassium channel；ischemia/reperfusion injury；isolated rabbit；hearts
1983年，Noma［1］应用膜片钳技术首先在豚鼠心肌细胞上发现ATP敏感性钾通道（KATP通道）。随着对KATP通道深入的研究发现KATP通道是将细胞代谢和细胞电活动耦联起来，从而调节细胞功能(如胰岛β2细胞的分泌功能、血管舒缩功能、缺血预适应中对心肌的保护作用等)的重要通道。本实验室的前期试验表明 ATP敏感性钾通道开放剂（KCOs）Pinacidil对离体兔心及外循环心内直视手术下的犬心缺血再灌注损伤具有保护作用，KATP通道的激活可能参与心脏内源性保护机制［2，3］。随着分子生物学技术的发展发现心肌细胞有sarcKATP通道和mitoKATP通道［4］，而哪型通道开放是心肌细胞获得保护的关键一直存在着争议。
本实验应用离体兔心Langendorff灌注模型观察分别以非选择性KATP通道开放剂Pinacidil和mitoKATP通道开放剂Diazoxide预处理对高钾停跳离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用，以及mitoKATP通道阻断剂5-HD应用后其心肌保护作用的变化，并探讨其可能机制。
1 材料和方法
1.1 材料 健康家兔40只，体重2.2～2.5kg，雌雄兼用，由本校实验动物中心提供。Pinacidil、Diazoxide、5-HD为美国Sigma公司产品，丙二醛、ATP、蛋白测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 离体心脏灌注模型的制备 兔耳缘注射肝素300u/kg，5min后击头部致昏，迅速开胸取出心脏连接于改良Langendorff灌注装置上，以95% O2和5% CO2饱和Krebs-Henseleit溶液（K-H）逆行灌注，温度37℃，灌注压力为10kPa， K-H液成分（mmol/L）：NaCl 118，KCl 4.7， NaH2PO4 1.19， MgCl2 1.19， CaCl2 2.5，NaHCO3 24.8， Glucose 11.1， EDTD-2Na 0.125，pH 7.4。
1.2.2 实验分组及步骤 离体心脏K-H液平衡灌注使心率稳定10min后，随机分为：(1)C组 (n=8)， St.ThomasⅡ晶体停搏液［成分(mmol/L)：NaCl 110，KCl 16，CaCl2 1.2，NaHCO3 10，MgCl2 16，pH 7.8］经主动脉逆行灌注使心脏停跳(4℃，10ml/kg，灌注压为10kPa)，停止K-H液灌注45min后恢复37℃K-H液灌注20min。(2)P组和D组(各n=8)，在心脏停跳前增加Pinacidil（10μmol/L）或Diazoxide（30μmol/L）灌注15min，灌注压为10kPa，其余步骤同对照组。(3)HP组和HD组(各n=8)，在心脏停跳前增加5-HD（100μmol/L）灌注15min其余步骤同P组或D组。
1.2.3 观察指标 (1)复跳时间（TR）：从再灌注开始到心脏恢复第一次机械搏动的时间。(2)血流动力学指标：通过左心耳向左心室内置入充满生理盐水乳胶小囊导管，调节左室舒张末压为0.6～1.0kPa。连接Macintosh微机，以Maclab V/4S生理实验系统实时记录左室功能的变化以及冠脉流量(CF)、心率(HR)。(3)生化指标：实验结束时，取左室心尖部组织，液氮储存，0℃条件下制备组织匀浆，采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定心脏组织中MDA含量，以nmol/mgprot表示，采用比色法测定SOD及肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性，以U/mgprot表示。采用高效液相色谱法测定三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）及一磷酸腺苷（AMP）的含量，并计算总腺苷酸（TAN）及细胞能荷(EC)。以μmol/gprot表示心肌腺苷酸含量。
1.3 统计学方法 所有数据均以x±s表示，用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理。组内比较采用t检验，不同时间点各组间心功能的比较采用两因素的方差分析，再灌注末各组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01为差异有显著性或非常显著性。
2 结果
2.1 血流动力学指标 见表1。各组缺血前比较各项心功能指标差异均无显著性。与缺血前比较，P组和D组用药后15min 的HR降低及±dp/dtmax上升明显(P＜0.05，P＜0.01)，再灌注后10min、15min HR、±dp/dtmax、LVDP逐渐恢复同缺血前（P＞0.05），于C组同时间点相比有显著性升高； HP组再灌注后15min HR、±dp/dtmax、LVDP与C组同时间点相比有显著性升高，HP组和HD组再灌注后各时间点较P组和D组
【关键词】 mitoKATP通道；缺血再灌注损伤；离体家兔；心脏
【Abstract】 Objective To investigate the protective effects of different ATP-sensitive potassium (KATP) channel opens， Pinacidil and Diazoxide ，on myocardium injury in isolated rabbit hearts caused by ischemia/reperfusion and possible changes after application of ATP-sensitive potassium channel blocker，5-HD. Methods Observation was made on rabbit hearts perfused with a Langendorff apparatus. 40 rabbits were randomly divided into four selected groups：1. Pinacidil；2. Diazoxide；3. 5-HD+Pinacidil；4. 5-HD+Diazoxide. All groups were subjected to 40 minutes occlusion， then followed by 20 minutes reperfusion as cardiac stopped functioning by cold cardioplegia. Any one of Pinacidil，Diazoxide ，Pinacidil or Diazoxide mixed with 5-HD was infused 15 minutes before cardioplegic heart rested in experimental group.Hemodynamics variables，levels of adenine nucleotides and lipid peroxide of the myocardium were measured. Results (1)In Group P， Group D and Group HP， the recovery of myocardial contractility and heart rate were faster and MDA level of myocardium and had much lower levels of activities of cretinkinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH). Moreover levels of myocardial adenosine triphosphate (ATP)（P＜0.05 or 0.01）were much higher.(2)In Group HP， however， the recovery of myocardial contractility and heart rate could not be as good as Group P， MDA level of myocardium and release amount of albumen was higher than P group. Conclusion The ATP-sensitive potassium channel openes may enhance myocardial protection against ischmia /reperfusion injury. The above effect of myocardial protection was only partially closed down by ATP-sensitive potassium channel blocker： 5-HD. These results shows that selective pharmacological agents implicate mitochondria and sarcolemmal KATP channels are not important in ischemic cardioprotection.
【Key words】 mitochondrial ATP sensitive potassium channel；ischemia/reperfusion injury；isolated rabbit；hearts
1983年，Noma［1］应用膜片钳技术首先在豚鼠心肌细胞上发现ATP敏感性钾通道（KATP通道）。随着对KATP通道深入的研究发现KATP通道是将细胞代谢和细胞电活动耦联起来，从而调节细胞功能(如胰岛β2细胞的分泌功能、血管舒缩功能、缺血预适应中对心肌的保护作用等)的重要通道。本实验室的前期试验表明 ATP敏感性钾通道开放剂（KCOs）Pinacidil对离体兔心及外循环心内直视手术下的犬心缺血再灌注损伤具有保护作用，KATP通道的激活可能参与心脏内源性保护机制［2，3］。随着分子生物学技术的发展发现心肌细胞有sarcKATP通道和mitoKATP通道［4］，而哪型通道开放是心肌细胞获得保护的关键一直存在着争议。
本实验应用离体兔心Langendorff灌注模型观察分别以非选择性KATP通道开放剂Pinacidil和mitoKATP通道开放剂Diazoxide预处理对高钾停跳离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用，以及mitoKATP通道阻断剂5-HD应用后其心肌保护作用的变化，并探讨其可能机制。
1 材料和方法
1.1 材料 健康家兔40只，体重2.2～2.5kg，雌雄兼用，由本校实验动物中心提供。Pinacidil、Diazoxide、5-HD为美国Sigma公司产品，丙二醛、ATP、蛋白测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 离体心脏灌注模型的制备 兔耳缘注射肝素300u/kg，5min后击头部致昏，迅速开胸取出心脏连接于改良Langendorff灌注装置上，以95% O2和5% CO2饱和Krebs-Henseleit溶液（K-H）逆行灌注，温度37℃，灌注压力为10kPa， K-H液成分（mmol/L）：NaCl 118，KCl 4.7， NaH2PO4 1.19， MgCl2 1.19， CaCl2 2.5，NaHCO3 24.8， Glucose 11.1， EDTD-2Na 0.125，pH 7.4。
1.2.2 实验分组及步骤 离体心脏K-H液平衡灌注使心率稳定10min后，随机分为：(1)C组 (n=8)， St.ThomasⅡ晶体停搏液［成分(mmol/L)：NaCl 110，KCl 16，CaCl2 1.2，NaHCO3 10，MgCl2 16，pH 7.8］经主动脉逆行灌注使心脏停跳(4℃，10ml/kg，灌注压为10kPa)，停止K-H液灌注45min后恢复37℃K-H液灌注20min。(2)P组和D组(各n=8)，在心脏停跳前增加Pinacidil（10μmol/L）或Diazoxide（30μmol/L）灌注15min，灌注压为10kPa，其余步骤同对照组。(3)HP组和HD组(各n=8)，在心脏停跳前增加5-HD（100μmol/L）灌注15min其余步骤同P组或D组。
1.2.3 观察指标 (1)复跳时间（TR）：从再灌注开始到心脏恢复第一次机械搏动的时间。(2)血流动力学指标：通过左心耳向左心室内置入充满生理盐水乳胶小囊导管，调节左室舒张末压为0.6～1.0kPa。连接Macintosh微机，以Maclab V/4S生理实验系统实时记录左室功能的变化以及冠脉流量(CF)、心率(HR)。(3)生化指标：实验结束时，取左室心尖部组织，液氮储存，0℃条件下制备组织匀浆，采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定心脏组织中MDA含量，以nmol/mgprot表示，采用比色法测定SOD及肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性，以U/mgprot表示。采用高效液相色谱法测定三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）及一磷酸腺苷（AMP）的含量，并计算总腺苷酸（TAN）及细胞能荷(EC)。以μmol/gprot表示心肌腺苷酸含量。
1.3 统计学方法 所有数据均以x±s表示，用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理。组内比较采用t检验，不同时间点各组间心功能的比较采用两因素的方差分析，再灌注末各组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01为差异有显著性或非常显著性。
2 结果
2.1 血流动力学指标 见表1。各组缺血前比较各项心功能指标差异均无显著性。与缺血前比较，P组和D组用药后15min 的HR降低及±dp/dtmax上升明显(P＜0.05，P＜0.01)，再灌注后10min、15min HR、±dp/dtmax、LVDP逐渐恢复同缺血前（P＞0.05），于C组同时间点相比有显著性升高； HP组再灌注后15min HR、±dp/dtmax、LVDP与C组同时间点相比有显著性升高，HP组和HD组再灌注后各时间点较P组和D组
