作者：程功，孙超峰，信捷职称论文写作发表网，黄欣，杜媛，张军波，王永红

【关键词】  窦房结；年龄因素；,Cx43；窦房结传导时间

　　Agerelated changes of Cx43 proteins in the region around the sinoatrial node of rats

　　【Abstract】 AIM: To observe the change of sinoatrial conduction time(SACT) and protein expression level of Cx43 in the region around sinoatrial nodes(SAN) in neonatal, adult and old SD rats, and to explore the molecular basis of SAN electrophysiological reconstruction. METHODS: The rats were anesthetized, and then ECG was recorded. Esophageal electrode was inserted to count SACT. The SAN was separated and prepared into 10 μm continuous frozen sections. Four neighboring sections were taken as a group, and then HE and Masson stainings were performed at the 2 middle sections. Immunohistochemical technology was used for the other 2 sections by FITC marked antibody of HCN4 and Cx43. Cx43 was measured with laser confocal microscope. RESULTS: ① SACT(ms) was  prolonged with ageing（neonatal 15.2±2.2, adult 17.6±1.6, old 19.3±0.9）. ② The expression of Cx43 in the region around SAN decreased with ageing（CT: neonatal 21.3±3.9, adult 15.7±2.7, old 6.9±1.8; Sinus: neonatal 14.2±4.2, adult 10.7±3.0, old 5.3±2.1）. CONCLUSION: Cx43 in the region around SAN possibly participates in electrophysiological molecular mechanism of agerelated SAN functional regression.

　　【Keywords】 sinoatrial node (SAN); age factors; Cx43; SACT

　　【摘要】目的： 研究幼年、成年和老年SD大鼠窦房结传导时间（SACT）变化，检测窦房结周围组织缝隙连接蛋白Cx43的表达，部分探讨窦房结电生理重构的分子基础. 方法： 大鼠麻醉后行心电图检查，放置食道电极，测量SACT. 分离窦房结及其周围组织，制备成10 μm厚的连续冰冻切片. 相邻4张为一组，分别行HE染色、Masson染色、FITC标记抗Cx43和抗HCN4的免疫组化法染色，激光共聚焦显微镜测量Cx43荧光强度. 结果： ① 随年龄增长，SACT(ms) 延长（幼年15.2±2.2, 成年17.6±1.6, 老年19.3±0.9）.  ② 窦房结周围组织Cx43表达随年龄增长逐渐降低，（界嵴处： 幼年组21.3±3.9，成年组15.7±2.7，老年组6.9±1.8；腔静脉窦：幼年组14.2±4.2，成年组10.7±3.0，老年组5.3±2.1）. 结论： 窦房结周围组织Cx43表达增龄性降低可能是构成窦房结功能增龄减退的一个重要的电生理分子基础.

　　【关键词】 窦房结；年龄因素； Cx43；窦房结传导时间

　　0引言

　　病态窦房结综合征（SSS）是由多种原因引起的窦房结起搏及冲动传导功能障碍而导致的临床综合征. 冲动传导功能障碍主要表现为窦房结的冲动在窦房结内传导延缓或阻滞和冲动传导到组织结构不完全相同的周围心房组织过程中发生延缓或阻滞，缝隙连结的主要功能是介导细胞之间电和化学信号的传递，而缝隙连结蛋白在大鼠窦房结内和窦房结周围组织分布完全不同，Cx40在大鼠窦房结及其周围组织不表达［1］，Cx43于大鼠窦房结周围区表达明确［2］，而Cx45表达有争议［2-3］，因此Cx43是大鼠窦房结的冲动传导到心房并在心房传导的主要蛋白［4］. 本课题观察大鼠窦房传导时间和窦房结周围组织Cx43表达的增龄性变化，以期部分探讨SSS的发病机制.

　　1材料和方法

　　1．1材料雄性SD大鼠24只，分为3组，每组8只. 3组分别为21 d幼年鼠、4 mo成年鼠（西安交通大学医学院实验动物中心提供）和30 mo老年鼠（四川省医学科学院实验动物研究所提供），常规饲料（西安交通大学医学院实验动物中心提供），Cx43蛋白特异性一抗（Rabbit antiCx43，美国Sigma公司），HCN4蛋白特异性一抗（Rabbit antiHCN4，美国chemicon公司）, IgG特异性二抗（Goat antiRabbit IgG）和多聚赖氨酸（美国Sigma公司），水溶性封片剂（武汉博士德公司），HM500O型冰冻箱切片机（德国ZEISS公司），TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜和LEICA Q550CW型图像采集与分析系统（德国Leica公司），BL420E生理机能实验系统（美国赛普公司）.
 
　　1．2方法

　　1．2．1SACT测定大鼠以40 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，记录心电图，放置食道电极，起搏频率选用高于基础心率的10%进行刺激，间隔30 s，脉宽10 ms，起搏电压15~25 mV. 最后一次脉冲与刺激终止后第一次P波之间的距离减去刺激前的平均窦性心动周期，所得值除2即得SACT，连续测量5次取平均值.
 
　　1．2．2大鼠窦房结及其周围组织Cx43的测定

　　1．2．2．1大鼠窦房结及其周围组织的制备 取出心脏，去除心室，暴露心房内面，以上腔静脉、下腔静脉、界嵴和房间隔为界分离窦房结，将组织块放入40 g/L的多聚甲醛固定后，置300 g/L的蔗糖溶液沉底，应用冰冻切片机垂直界嵴连续切片，制成10 μm厚的切片-80℃备用.
 
　　1．2．2．2染色方法将连续组织切片的每相邻4张作为一组，一张做HE染色，一张做Masson染色，另两张分别行免疫组化染色，晾干切片，PBS洗去OCT, 40 g/L多聚甲醛固定30 min, PBS洗10 min×3次，10 g/L tritonx100PBS浸泡30 min，PBS洗10 min×3次，山羊血清室温下封闭1 h，行免疫组化染色的两张切片分别加上特异性一抗（兔抗Cx43抗体，稀释比例为1∶3000；兔抗HCN4抗体，稀释比例为1∶200），置于湿盒中4℃过夜. PBS洗10 min×3次，分别加FITC标记的山羊抗兔IgG特异性二抗，置于37℃恒温箱中50 min，PBS洗10 min×3次，水溶性封片剂封片，立即在激光共聚焦显微镜下观察，在495 nm波长时激发，在525 nm波长时可见组织片上产生绿色荧光.

　　1．2．2．3Cx43表达水平的测定利用激光共聚焦显微镜观察，可见Cx43分布于窦房结以外心房组织，窦房结区无表达，在窦房结与周围界嵴和腔静脉窦连接处，选取5处区域测量Cx43荧光强度值，计算其平均值，减去阴性对照组织片中相应部位的荧光强度值后，即得到了实际荧光强度值.

　　统计学处理： 计量数据用x±s表示，用SPSS11.0软件包进行统计分析. 3组均数的比较采用单因素方差分析，若3组之间有统计学差异，则进行组间LDS-t检验，P<0.05视为有统计学意义.

　　2结果

　　2．1大鼠SACT的增龄性改变3组大鼠SACT方差分析显示有显著性差异(P<0.01)，说明随年龄增长，大鼠SACT延长. 用LDS test统计方法对大鼠SACT(ms)进行组间分析，幼年(15.2±2.2),成年（17.6±1.6）,老年（19.3±0.9），两两间比较有统计学显著性差异(P<0.01).
 
　　2．2大鼠窦房结周围组织Cx43表达的增龄性改变激光共聚焦显微镜下观察，产生荧光的部位有Cx43表达，结合相邻组织片抗HCN4抗体染色，以及HE染色、Masson染色，即可见Cx43分布于窦房结以外心房组织，窦房结区无表达，未发现Cx43阳性的心房肌延伸到HCN4阳性的窦房结区，产生的绿色荧光呈短线状分布于相邻心房肌细胞闰盘处(图1A,B,C).

 
　　3组大鼠窦房结周围组织Cx43荧光强度经方差分析显示具有显著性差异P<0.01，说明随年龄增长，大鼠窦房结周围组织Cx43表达量逐渐减少，用LDSt统计方法对大鼠窦房结周围界嵴处和腔静脉窦处Cx43的表达进行组间分析(表1).

　　A：幼年大鼠（向左箭头示SAN中央动脉，向上箭头示界嵴，向下箭头表示腔静脉窦）；B： 成年大鼠（向左箭头示SAN中央动脉，向上箭头示界嵴）；C： 老年大鼠（向左箭头示SAN中央动脉，向上箭头示界嵴）.

　　图1窦房结Cx43免疫荧光