【摘要】  目的： 探讨哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞与IL? 4,IL? 5的水平变化及其相互关系. 方法： 采用流式细胞技术检测40例哮喘患者和40例健康对照者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平，采用ELISA法检测外周血中IL? 4,IL? 5水平. 结果： 哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞低于健康对照者(P<0.01)；急性发作期哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞低于非急性发作期(P<0.01)；哮喘患者IL? 4,IL? 5的表达水平高于健康对照者(P<0.05)；急性发作期患者IL? 4, IL? 5的表达水平高于非急性发作期(P<0.05)；急性发作期哮喘患者外周血CD4+CD25+T细胞与IL? 4, IL? 5的表达水平呈负相关（r分别为-0.675， -0.767, P<0.01）. 结论： CD4+CD25+调节性T细胞在哮喘的疾病活动中起着重要作用，是导致哮喘患者细胞免疫失调的重要原因.

【关键词】  哮喘；CD4+CD25+T细胞；白细胞介素4；白细胞介素 5

　0引言
 
　　从1986年起,Thl/Th2平衡理论作为过敏性疾病如支气管哮喘发病机制中的核心已为大多数人所接受. 在此基础上,T细胞尤其是调节性T细胞在支气管哮喘中的作用逐渐引起人们的关注. 目前已知至少有4种主要的CD4+调节性T细胞在哮喘发病中起作用，包括Th3 细胞，Tr1细胞，NKT细胞及CD4+CD25+T细胞［1］. 而CD4+CD25+T细胞由于其具有独特的作用方式和功能特征,引起了国外学者的广泛关注［2-4］,但国内有关CD4+CD25+T细胞与哮喘关系的研究报道尚少,我们进行了这方面的研究,以期探讨哮喘患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达及其与Th2型细胞因子IL? 4，IL? 5表达水平的关系.

　　1对象和方法

　　1.1对象哮喘组：哮喘患者40（男20，女20）例，年龄（33.7±9.2）岁. 所有病例均符合2003年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘防治指南［5］中规定的诊断标准. 其中急性发作期20例，该组患者中，轻中度12例，重度8例；非急性发作期20例. 正常对照组：健康献血者40（男22，女18）例，年龄（30.5±8.8）岁，均无近期感染及过敏性疾病史.

　　1.2 方法

　　1.2.1CD4+CD25+T细胞的测定分别采集哮喘患者及健康献血者外周静脉血2 mL，肝素抗凝；取肝素抗凝的全血100 μL，加入CD4? PE和CD25? FITC单克隆抗体20 μL, IgG1? PE和IgG1? FITC作为同型对照，室温闭光反应30 min；加2 mL溶血剂在室温下溶解红细胞约10 min；PBS洗涤，离心5 min（1500 r/min),弃上清；每份标本加入1 g/L多聚甲醛500 μL后用流式细胞仪检测. 流式细胞仪为Beckman? CoulterXL100(Coulter公司产品).

　　1.2.2IL? 4, IL? 5的测定清晨取静脉血3 mL，离心后取血清，置于-70℃冰箱冻存. 血清IL? 4，IL? 5的测定采用ELISA法. 试剂盒购自上海森雄公司. 操作步骤严格按说明书进行.

　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，使用SPSS12.0统计软件进行两组间均数比较的t检验,CD4+CD25+T细胞百分率与IL? 4， IL? 5表达水平的关系采用秩相关分析，以P﹤0.05认为差异显著.

　　2结果

　　2.1哮喘组和对照组CD4+CD25+T细胞百分率及IL? 4, IL? 5的比较哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比明显低于健康对照者；IL? 4, IL? 5的表达水平明显高于健康对照组. 性别，年龄与CD4+CD25+T细胞及IL? 4，IL? 5表达不相关（表1）.

　　表1哮喘组和对照组CD4+CD25+T细胞百分率及IL? 4，IL? 5的比较（略）

　　bP<0.01 vs对照.

　　2.2不同临床分期哮喘组CD4+CD25+T细胞百分率及IL? 4，信捷职称论文写作发表网，IL? 5的比较急性发作期哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞比率明显低于非急性发作期哮喘患者；L? 4，IL? 5的表达水平高于非急性发作期患者（表2）.

　　表2急性发作期和非急性发作期CD4+CD25+T细胞百分率及IL? 4，IL? 5的比较（略）

　　bP<0.01 vs非急性发作期.

　　2.3急性发作期哮喘患者CD4+CD25+T细胞百分率与IL? 4表达水平的相关性分析20例急性发作期哮喘患者IL? 4的表达水平为（37.2±10.2） ng/L，与CD4+CD25+T细胞百分率呈负相关（rs=-0.675, P<0.01），即随着哮喘患者外周血CD4+CD25+T细胞数量的减少，其IL? 4的表达水平升高（图1）.

　　图1急性发作期哮喘患者CD4+CD25+T细胞百分率与IL? 4表达水平的相关性（略）

　　2.4急性发作期哮喘患者CD4+CD25+T细胞百分率与IL? 5表达水平的相关性分析20例急性发作期哮喘患者IL? 5的表达水平为(83.9±11.2) ng/L，与CD4+CD25+T细胞百分率呈显著负相关（rs =-0.767, P<0.01），即随着哮喘患者外周血CD4+CD25+T细胞数量的减少，其IL? 5的表达水平升高（图2）. 

　　图2急性发作期哮喘患者CD4+CD25+T细胞百分率与IL? 5表达水平的相关性（略）

　　3讨论
  
　　目前普遍认为哮喘是一种慢性气道炎症,有多种炎症细胞、炎性介质和细胞因子参与其炎症过程. 随着免疫学及分子生物学研究的深入,越来越多的证据表明免疫功能紊乱在哮喘发病机制中起着重要作用.
 
　　CD4+CD25+调节性T细胞是1995年Sakaguchi等首次报道的具有独特免疫调节作用的一种专职抑制细胞［6］. CD4+CD25+调节性T细胞最初来源于胸腺， 随后可以在外周性免疫器官持续产生. 据研究在人类健康个体的外周循环血中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的5%~10% . 这种细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能 . 其免疫无能性表现为对高浓度IL? 2单独刺激，或经TCR刺激如可溶性或固相包被抗CD3mAb无反应(即无增殖性)，也不分泌IL? 2，但对非TCR依赖性刺激则有正常反应；免疫抑制性表现在经TCR介导的信号刺激活化后不仅能抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，还能抑制其免疫功能，且这种免疫抑制性不具有MHC限制性，能够抑制同种同型或同种异型T细胞的增殖. CD4+CD25+调节性T细胞的量很少，但其在自身免疫性疾病，移植排斥反应和过敏性疾病中发挥着重要作用［6-7］.
 　 
　　在哮喘炎症反应过程中IL? 4被认为是起主导作用的因子，它不仅可以促进B细胞活化，使其高效合成分泌IgE，还作用于CD4+细胞促其转变成Th2表型细胞；而IL? 5也是哮喘炎症中关键的调节因子，它的作用是促进嗜酸性粒细胞的分化、黏附 ,还可以通过诱导嗜酸性粒细胞释放炎性介质导致炎症反应［8-10］.
   
　　我们的实验表明，哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞明显低于健康对照者，急性发作期哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞明显低于非急性发作期哮喘患者，且随着疾病的加重呈明显减少趋势；而哮喘患者IL? 4,IL? 5的表达水平明显高于健康对照者，急性发作期患者IL? 4,IL? 5的表达水平高于非急性发作期. 我们的实验还显示哮喘患者外周血CD4+CD25+T细胞与IL? 4,IL? 5的表达水平呈负相关. 说明在哮喘发作期CD4+CD25+T细胞不能有效的抑制患者CD4+T细胞的活化和增殖，导致哮喘患者外周血中活化的CD4+T细胞比例明显增加并产生了Th2型细胞因子，使IL? 4， IL? 5分泌增多,引发一系列免疫级联反应如这些细胞因子促进嗜酸性粒细胞聚集，增加嗜酸性粒细胞活性，促进IgE的产生，形成气道慢性炎症，气道反应性增高,从而导致了哮喘发作.
  
　　总之 ,我们的研究结果表明哮喘患者外周血中存在异常比例的CD4+CD25+T细胞 ,可能参与了哮喘的发生和发展 ,通过增强CD4+CD25+T细胞作用的治疗可能成为哮喘治疗的有效手段. 继续深入的研究将有助于我们更好的理解哮喘的发病机制 ,也将为哮喘的免疫治疗提供新的思路.

【参考文献】
  ［1］Umetsu DT, Akbari O, Dekruyff RH.Regulatory T cells control the development of allergic disease and asthma［J］ .J Allergy Clin Immunol, 2003,112 (3):480-487.

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　　［3］Shimizu J,Yamazaki S,Takahashi T, et al. Stimulation of CD4+CD25+ Regulatory T cells through GITR breaks immunological self? tolerance［J］. Nat Immunol, 2002,3:135-142.

　　［4］Pasare C, Medzhitou R. Toll pathway? dependent blockade of CD4+CD25+T cell? mediated suppression by dendritic cells［J］ . Science,2003,299:1033-1036.

　　［5］中华医学会呼吸病学分会哮喘学组. 支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗及教育和管理方案) ［J］. 中华内科杂志，2003，42（11）：817-818.

　　［6］Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self? tolerance maintained by activated T cell expressing IL? 2 receptor alpha? chains(CD25) ［J］.J Immunol, 1995,160:1151-1164.

　　［7］Jonuleit H,Schnitt E,Stassen M,et al.Identification and functional characterization of human CD4+CD25+T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood［J］. J Exp Med,2001,193:1285-1294.

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　　［9］Frew AJ,Dasmahapatra J.The role of T lymphocytes in allergic airway disease［J］.Thorax,1995,50(9):919.