1.3AdEasyE6E7重组腺病毒感染293细胞的鉴定脂质体包裹AdEasyE6E7同源重组腺病毒基因组质粒转染293包装细胞1~2 d后，光镜下可观察到空斑形成，细胞变圆、肿胀、脱壁、细胞核变大等病变.    荧光显微镜下观察，重组腺病毒感染的293细胞和pAdtrackCMV感染的293细胞，在培养1～2 d后有EGFP表达，并逐渐增多. AdEasyE6E7重组腺病毒感染的293细胞，RTPCR检测显示有1条860 bp条带，而pAdtrackCMV空载体感染的293细胞的相应位置无特异条带（图3）.  AdEasyE6E7重组腺病毒感染的293细胞，用Western Blot检测显示有1条能与E6单抗特异性结合的蛋白印迹条带，而pAdtrackCMV空载体重组后的腺病毒AdEasyCMV感染的293细胞的相应位置无特异条带（图4）. 经终点稀释实验测定得到重组复制缺陷型病毒滴度为6.9×1010 pfu/L.

　　1:  Marker: λHindⅢ;  2:  pAdTrackk14E6E7/BamHⅠ; 3: 重组后的pAd TrackCMV E6E7/PacⅠ; 4: 重组后的pAd TrackCMV.

　　图2PacⅠ酶切鉴定AdEasyE6E7 （略）

　　1: Marker: 100 bp DNA Marker; 2: RTPCR 产物: E6E7基因 （860bp）; 3: RTPCR阴性对照.

　　图3RTPCR鉴定AdEasyE6E7 转染的293细胞中E6E7的表达（略）

　　1:  E6E7; 2: NO  E6E7.

　　图4Western  Blot鉴定AdEasyE6E7/AdEasyCMV（略）

　　3讨论

　　目前基因治疗中应用最广泛的生物病毒载体有反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体，其中腺病毒的优于其他载体的特点［4-5］. 腺病毒载体可转导非分裂细胞，并在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量，最后腺病毒载体进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高. 已被美国FDA批准作为基因治疗载体应用于临床实验.
 
　　我们先将AdEasy1骨架载体转化到用CaCl2制备的BJ5183感受态中，然后再将线性化的pAdtrackCMVE6E7转化进含有AdEasy1的BJ5183制成感受态，同源重组［6-7］. 已转化了AdEasy1质粒的BJ5183细胞更方便进行细菌内同源重组，免去了在真核细胞内重组筛选复杂、费时的缺点. 为了验证重组腺病毒是否带有目的基因E6E7，进行了如下鉴定： 对pAdtrackCMVE6E7质粒酶切和测序，结果证明目的基因E6E7正确插入到穿梭载体； pAdtrackCMVE6E7经PacⅠ酶切后，可见4.5 kb和23 kb两条带，说明重组成功；构建腺病毒载体的穿梭质粒pAdtrackCMV中的构建元件已插入EGFP表达盒，重组腺病毒转染293细胞后，通过荧光显微镜观察，可见293细胞有绿色荧光蛋白表达，并逐渐出现生长停止和空斑形成，证明AdEasyE6E7已包装入293细胞； 通过RTPCR和Western  blot方法证明了AdEasyE6E7转染293细胞后有E6E7核酸和蛋白的表达. 这个载体的构建对于进一步研究HPV16 E6E7体内、体外基因治疗实验奠定了基础.

　　【参考文献】

　　［1］ Anderssom S, Rylander  E, Larsson B, et al. The role of human papillomavirus in cervical adenocarcinoma carcinogenesis ［J］. Eur J Cancer, 2001,37(2):246-250.

　　［2］ Cheng K, Fraga D, Zhang C, et al. Adenovirusbased vascular endothelial growth  factor gene delivery to human pancreatic islets ［J］. Gene Ther, 2004,11（14）:1105-1116.

　　［3］ 滑玮，辛晓燕，苏明权，等. 修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定［J］. 第四军医大学学报，2003,24（8）:734-737.

　　［4］     Siemens DR, Crist S, Austin JC, et al. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue   specificity in a bladder cancer model. ［J］ J Urol  2003,170:979-984.
 
　　［5］  Davis AR, Wivel NA, Palladino JL, et al. Construction of adenoviral vectors［J］.  Mol Biotechnol, 2001,18:63-70.

　　［6］ 郑权，黄宗海，信捷职称论文写作发表网，汤福祥等. 应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒［J］. 第一军医大学学报，2003,23（6）:575-577.

　　［7］     Green AP, Huang JJ, Scott MO, et  al. A new scalable method for the purification   of recombinant adenovirus vectors ［J］. Hum Gene Ther,   2002,13:1921-1934.