2结果

    2.1染料木黄酮对3AO细胞形态的影响倒置显微镜下可见，3AO细胞呈单层生长，细胞呈椭圆形或多角形，胞核圆形或椭圆形，胞质透亮. 经染料木黄酮处理后，细胞形状变窄，胞质透亮度下降，颗粒感增强，部分细胞胞突回缩变圆，脱落呈悬浮状，并见细胞碎片. 且这些变化随染料木黄酮剂量的增加和作用时间的延长而加重. 至72 h，细胞回缩成不规则圆形，可见大量细胞碎片. 电镜下可见细胞超微结构发生典型的凋亡形态学改变.

    2.2染料木黄酮对3AO细胞生长的抑制作用MTT试验表明染料木黄酮对3AO细胞的抑制作用随浓度的升高和用药时间延长而增强，经计算IC50为10 mg/L，药物浓度与作用时间之间有交互作用（P<0.01，表1）.

    2.3TUNEL法检测确定凋亡光镜下，10 mg/L染料木黄酮作用48 h后，出现大量阳性凋亡细胞，核深染，成斑点状或斑块状；而对照组细胞核几乎无着色（图1）. 加药组阳性细胞数量平均为14.32±2.56，而对照组中阳性细胞数量仅为1.28±1.55，二者差异显著（t=13.78， P＜0.01）.表1MTT法检测染料木黄酮对3AO细胞增值的影响对照和各浓度各时间点组间比较；cP<0.01 vs对照和各时间点组间比较.

    2.4染料木黄酮对3AO细胞周期和凋亡率的影响流式细胞仪结果显示，和对照组相比，染料木黄酮处理的3AO细胞出现细胞周期中G2/M期细胞显著增多，S期细胞显著减少，表现出G2/M期阻滞；此外，10 mg/L染料木黄酮给药48 h在G0/G1前出现典型亚二倍体凋亡峰. 与对照组相比，5 mg/L与10 mg/L染料木黄酮作用12，24，48 h后抑制率两两之间均差异显著（P<0.01），药物处理不同时间各组间抑制率亦均有显著差异（P<0.01）. 表明染料木黄酮诱导3AO细胞凋亡随浓度增高和时间延长而增强，其中10 mg/L染料木黄酮作用48 h后抑制率达38.1%. 卵巢癌中，ERβ蛋白表达定位于胞核，阳性反应为核深染成深棕色. 光镜下可见染料木黄酮作用后，ERβ表达明显增强（图2）.

    3讨论

    本实验采用了多种检测细胞增殖活性及凋亡的方法，检测了染料木黄酮对3AO细胞凋亡作用的量效和时效关系，较肯定地证明了一定浓度的染料木黄A: 对照酮可诱导3AO细胞凋亡，抑制其增殖. MTT试验中，随着染料木黄酮浓度的升高，3AO细胞的生长均受到不同程度的抑制. 当剂量达10 mg/L和20 mg/L时，抑制作用明显，表明染料木黄酮对3AO细胞的抑制作用随浓度的升高和用药时间延长而增强. 作为一种植物雌激素，染料木黄酮结构与17β雌二醇相似［8］，可与雌激素受体(ER)结合，结合后的潜在健康效应表现为U型剂量效应关系，表现为类雌激素活性和抗雌激素活性. 染料木黄酮的雌激素作用和抗雌激素作用，取决于剂量及机体甾体雌激素状态，具有双向调节平衡功能. 此结论与李昱等结论不同［9］.

    实验中观察到染料木黄酮作用于3AO细胞系后，诱导卵巢癌细胞发生凋亡，从而抑制细胞生长. 倒置显微镜下可见酷似凋亡的细胞，电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变. TUNEL法更直观地观察到大量阳性凋亡细胞.

    卵巢癌是性激素依赖性肿瘤，雌激素有利于卵巢癌的发生，雌激素通过与ERα，ERβ的同二聚体及异二聚体结合发挥生物学作用. Rutherford等［10］发现，在卵巢癌中，ERα/ERβ mRNA的比率升高，ERα相对于ERβ的过表达是卵巢癌发生的标志，而此结果系ERβ表达下调所致. 本实验免疫细胞化学结果显示：染料木黄酮作用后，ERβ表达明显加强. 说明染料木黄酮作为一种植物雌激素，当达到一定浓度时，与雌激素竞争性与ERβ结合，表现为抗雌激素活性，从而诱导卵巢癌细胞发生凋亡，发挥抗肿瘤作用. 因此染料木黄酮可能通过ERβ途径发挥药理作用. 并且，染料木黄酮可能独立的通过雌激素受体途径抑制细胞增殖和因子的表达. 我们的发现揭示了染料木黄酮化学预防卵巢癌的可能机制，且染料木黄酮几乎无毒性［11］，为染料木黄酮临床治疗卵巢癌提供一定的实验依据.

    【参考文献】

    ［1］ Griffiths K, Morton MS, Denis L. Certain aspects of molecular endocrinology that relate to the influence of dietary factors on the pathogenesis of prostate cancer［J］.Eur Urol,1999, 35:443-455.

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    ［4］  Chen X, Anderson JJ. Isoflavones inhibit proliferation of ovarian cancer cells in vitro via an estrogen receptordependent pathway［J］.Nutr Cancer,2001,41(12):165-171.

    ［5］  Shao ZM, Wu J, Shen Z. Genistein exerts multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells［J］. Cancer Res, 1998,58(21):4851-4857.

    ［6］  Tanaka T, Kohno H, Tanino M, et al. Inhibitory effects of estrogenic compounds, 4nonylphenol and genistein, on 7,12dimethylbenz［a］anthraceneinduced ovarian carcinogenesis in rats［J］. Ecotoxicol Environ Saf, 2002,52(1):38-45.

    ［7］  Hong HJ, Chan P, Liu JC, et al. Angiotensin II induces endothelin1 gene expression via extracellular signalregulated kinase pathway in rat aortic smooth muscle cells［J］. Cardiovasc Res,2004,61(1):159-168.

    ［8］  黄艳红,辛晓燕,陈亚琼.染料木素与17β雌二醇对去势大鼠生殖系统的影响［J］.第四军医大学学报,2004,25(6):551-553.

    ［9］  李昱,米粲. Genistein对人卵巢癌细胞系抑制增殖和促进凋亡作用及机制探讨［J］. 肿瘤,2003,23(6):490-493.

    ［10］  Rutherford T, Brown WD, Sapi E, et al.Absence of estrogen receptorbeta expression in metastatic ovarian cancer［J］. Tet Gynecol, 2000,96(3):417-421.

    ［11］ 金伟，马力. 染料木黄酮对顺铂诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的增敏作用［J］. 第四军医大学学报,2005,26(8): 761-763.