【关键词】 结核分支杆菌；rPOB基因；KatG基因；rpsL基因；SSCP；药物耐受性
Studies of Mycobacterium tuberculosis multi-drug resistant gene
【Abstract】 Objective To evaluat the importance of rPOB、KatG and rpsL gene mutation detection in multi-drug resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Methods rPOB、KatG and rpsL gene mutation of 54multi-drug resistant clinical isolates，which is INH RFP and Sm resistance and 54 drug susceptible strains were analyzed using polymerase chain reaction-single strand conformation (PCR-SSCP).Results SSCP pattern of H37RV strain as control，SSCP pattern of rPOB，rpsL PCR amplification from drug susceptible strains were all the same as control. The specificity was 100%. However，the different SSCP pattern of KatG gene were found in 2 susceptible strains. The specificity was 96.3%. Gene deletion of rPOB、KatG and rpsL were not found in all clinical isolates tested. SSCP patterns of rPOB gene were different from control in 49 drug resistant clinical isolates. SSCP patterns of KatG gene were different from control in 32drug resistant clinical isolates，SSCP pattern of rpsL gene were different from control in 40 drug resistant clinical isolates. The sensitivity were 90.1% (rPOB)，59.3% (KatG) and rpsl (74.1%)，respectively. Conclusion The major mechanism of RFP，INH，SM resistant drug was rPOB、KatG and rpsL gene mutation，respectively PCR-SSCP may be one of the way which applied to drug resistant detection of Mycobacterium tuberculosis.
【Key words】 Mycobacterium tuberculosis；rPOB gene；KatG gene；rpsL gene；SSCP；drug tolerance
我国是结核病疫情最严重的国家之一，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。近年来随着分子生物学的研究进展人们对抗结核分枝杆菌的药理作用位点和结核分枝杆菌耐药机制，尤其是耐异烟肼、利福平和链霉素。目前，结核分支杆菌耐药性测定仍多采用绝对浓度法、比例法等经典方法。但由于结核分支杆菌生长缓慢，而耐药结核分支杆菌生长更为缓慢，其耐药性测定需6～8周甚至更长，不能及时指导临床用药。新进开展的Bactec法药敏检测因其价格昂贵等诸多不便限制了其广泛使用。据报道［1］INH耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因（KatG）有关、而某些结核分支杆菌耐SM的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因（rpsL）和16SrRNA编码基因（rrs）突变所致［2］，同时也证实了结核分支杆菌耐利福平与RNA聚合酶的β亚基的编码基因rPOB的突变有关［3］。笔者采PCR-SSCP银染法对54例（同时耐INH、RFP、SM）和45例（药物敏感）肺结核病人痰标本临床分离株同时进行KatG基因、rPOB基因和rpsL基因突变分析。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 H37RV标准株来源于中国药品生物制品检定所，45例敏感株和54例同时耐INH、RFP、SM的临床分离株来自珠海市人民医院、沈阳市胸科医院等。按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏试验证实为结核分支杆菌，耐药株则同时对异烟肼、利福平、链霉素耐药。药物的最高浓度为异烟肼10mg/L、利福平250mg/L、链霉素100mg/L。
1.2 方法
1.2.1 细菌DNA制备 临床分离株DNA用常规酚/氯仿提取，并将纯化后的提取物置于－20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增 采用25μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2mmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，置DNA扩增仪扩增，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带、rpsL出现267bp条带即为扩增阳性。
1.2.3 SSCP银染 PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10min，立即冰浴5min，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为6℃、100V电压，电泳约2～3h，电泳结束后，取凝胶板行硝酸银染色，观察结果并照相。
2 结果
(1)PCR扩增以结核分支杆菌H37RV标准株DNA为对照。45株药物敏感株和54株耐多药临床分离株KatG、rPOB和rpsL基因均扩增成功。
(2)45株结核分支杆菌敏感株rPOB和rpsL基因PCR扩增片段SSCP图谱与H37RV株相比均未发现异常，特异性为100%。KatG基因扩增片段SSCP有2株与H37RV相比泳动异常，特异性为95.6%。54株同时耐INH、RFP和SM的临床分离株中，与H37RV相比，KatG基因32株泳动异常，22株无改变；rPOB基因49株泳动异常，5株无改变；rpsL基因40株泳动异常，14株无改变，SSCP检测KatG基因、rPOB基因、rpsL基因的阳性率分别为59.3%、90.1%和74.1%。（见表1）表1 结核分支杆菌KatG、rPOB、rpsL基因扩增及 SSCP结果注：a．SSCP图谱与H37RV有差异
3 讨论
笔者采用PCR-SSCP技术分析了54株同时耐异烟肼、利福平和链霉素的多耐药临床分离株及45株临床敏感株的KatG、rPOB和rpsL基因突变。结果表明：多耐药临床分离株SSCP，KatG突变率为59.3%，药物敏感株有4.4%的突变率。rPOB突变率为90.1%，rpsL突变率为74.1%，两者药物敏感株均无改变。表明结核分支杆菌异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG有关，KatG基因在INH耐药中起主导作用。最近的研究结果表明，大多数的耐SM的产生是由于核糖体蛋白S12编码基因（rpsL）或16SRNA编码基因（rrs）突变所致。本文有72.2%的结核分支杆菌耐SM临床分离株有SSCP泳动异常，表明其rpsL基因发生了突变，这与Morris等的结果相似［2］。由此可见rpsL基因突变是结核分支杆菌耐SM临床分离株最常见的基因突变。但有一部分耐INH株未检测到KatG缺失或突变，提示某些菌株的耐INH形成可能与KatG无关。如inhA基因、ahpC基因也与INH耐药有相关性［4，5］，INH耐药机制尚有待进一步研究。据国内外报道［6，7］耐RFP结核分支杆菌rPOB基因突变的发生率为92.7%～97.6%，敏感株无突变。这与本文的结果相近，表明结核分支杆菌耐利福平与RNA聚合酶的β亚基的编码基因rPOB有关，rPOB突变已成为结核分支杆菌耐RFP的主要遗传指标。在耐INH、RFP和SM结核分支杆菌中，有60%左右同时有INH、RFP和SM遗传标志改变，20%～30%有2种耐药遗传标志改变，10%～20%只有rPOB点突变。说明75%以上耐多药分离株是各种药物靶分子的编码基因突变所致。同时有报道［6］
