作者：刘锐，黄沙，金岩，吴红，姜玲，刘涛

　【关键词】  ,碱性成纤维细胞生长因子

    Preparation and characteristic test of bFGFimpregnated microsphere

　　【Abstract】 AIM: To prepare the basic fibroblast growth factor (bFGF)impregnated microsphere and to study its characteristics. METHODS:  The bFGFimpregnated microsphere was prepared by improved emulsified coldcondensation method. The physical properties, drug content and encapsulation were detected. The drug release in vitro was measured by ELISA. RESULTS:  The average diameter of microsphere was (12.4±3.6) μm, the average drug content was 0.24% and encapsulation was 96.82%. In vitro, 28.23% of bFGF was sustainedreleased on the first day, 57.19% from the second to the fifth day and 93.94% by the seventh day. CONCLUSION:  The preparation method is simple, rapid and accurate and the release of bFGF from the microspheres can be sustained for a longer time.

　　【Keywords】 basic fibroblast growth factor; microsphere; sustainedrelease; encapsulation

　　【摘要】 目的：制备复合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的可降解缓释微球，考察其各项性能，为进一步应用于组织工程奠定基础. 方法：采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF的缓释微球，测定微球形态、粒径、载药率和包裹率等，并采用ELISA法考察其体外bFGF的缓释效能. 结果：缓释微球平均粒径(12.4±3.6) μm；平均载药率为0.24%，平均包裹率为96.82%.  d 1体外释放28.23%，2~5 d时累积释放率达到57.19%, d 7时释放减慢且累计浓度为93.94%. 结论：复合bFGF的缓释微球制备工艺简便，性能优良；可在较长时间内持续释放活性bFGF，与组织工程支架的结合应用具有可行性.

　　【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子；微球；缓释；包裹率

　　0引言

　　生长因子的应用一直是组织工程领域的重要课题之一. 它具有多种生物学活性，可提供有利于细胞生长的微环境，促进新生组织血管生成等［1］. 但由于生长因子半衰期短，溶液进入体内后迅速扩散、变性或酶解，难以保持其生物活性［2］. 我们制备复合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的缓释微球载体，并考察微球形态、粒径、载药率、包裹率及释放效果等性能，以期利用此种新型载体在较长时期内持续释放bFGF，为今后与组织工程支架的结合应用奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　明胶(等电点50，相对分子量99 000，华美生物工程公司)，人重组bFGF溶液(25 mg/L，等电点9.6，Sigma公司)，人bFGF定量EIA试剂盒（QuantiKineR, R&Dsystems），250   g/L戊二醛，丙酮，异丙醇，无水乙醚，液体石蜡，氨基乙酸为国产分析纯，Span80(Sigma公司)为进E1分析纯，水为双蒸水，JJ1型精确电子搅拌器仪，TGL16G高速离心机，GENESIS冻干机(Virtis公司)，BX41数码显微镜（Olympus).

　　1.2方法

　　1.2.1复合生长因子微球的制备将含有10 g/L Span80的液体石蜡30 mL置于三口瓶中预热至55℃，快速搅拌下滴加入同样温度的明胶水溶液4 mL，并调节搅拌速度至450 r/min，继续搅拌10 min；形成油包水乳剂后迅速改冰浴，继续搅拌10 min，使其完成固化；加入250 g/L戊二醛0.1 mL，搅拌下预固化2 h，4℃固化24 h，用适量丙酮、异丙醇、乙醚洗涤，挥去乙醚，信捷职称论文写作发表网，真空干燥，得淡黄色粉末状微球，将200 μL的bFGF溶液滴加在20 mg的冻干明胶微球上，在室温下保持30 min以使bFGF完全融入微球. 钴60照射灭菌封存. 以丙酮为分散剂将空白微球样本及含有bFGF的微球样本置于光镜下，观察其外形及分散度. 同时测量500个微球的直径计算其平均粒径. 以算术平均径为微球的平均粒径，计算公式为：平均粒径=n1d1+n2d2+…+nndn/n1+n2+n3+…+nn    式中n1,n2…nn为粒子数，d1,d2…dn为粒径.

　　1.2.2微球含量及缓释性能测定根据人bFGF定量EIA试剂盒说明书配置标准液，在492 nm处测各孔A值. 以标准品0，8，16，31，62，125，250和500 ng/L之A值作出标准曲线并拟合线形回归方程. 取微球样品20 mg,放入PBS缓冲液中，加热至完全溶解，冷却后再用缓冲液稀释定容. 测出A492 nm值，然后在标准曲线上查处相应bFGF含量，并由此计算出微球的载药率以及标准率. 载药率=（bFGF质量/缓释微球质量）×100%. 包裹率=（bFGF质量/缓释微球中bFGF理论质量）×100%. 取缓释微球(2 mg)，用PBS缓冲液100 mL作为溶出介质. 药物体外溶出仪的温度保持在(37.0±0.5)℃．磁力搅拌转速100 r／min. 分别于各时间点(1，2，3，4，5，6，7 d)取样100 μL. 每次取样后，立即补充同温度的PBS缓冲液100 μL. 按1~7 d顺序，将稀释10倍的样品，分别加入微孔板7个孔中，每孔加样50 μL并同时加入样品稀释液各50 μL. 将反应板充分混匀后置37℃ 120 min. 用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干. 每孔加入第一抗体工作液50 μL,将反应板置37℃ 60 min. 洗板，并在每孔中加入酶标抗体工作液100 μL.将反应板放置于37℃ 60 min. 洗板后加入底物工作液100 μL，置37℃暗处反应10 min. 每孔中加入一滴终止液，混匀. 在A492 nm处测各孔值. 根据A值在标准曲线上查出相应bFGF含量.

　　2结果

　　2.1缓释微球的形态和粒径空白缓释微球呈圆球状，形态及粒径大小较均匀（Fig 1A）；复合有bFGF的缓释微球经溶涨体积变大，形态饱满(Fig 1B). 微球粒径7~20 (12.4±3.6) μm，占85.6%.

　　2.2bFGF标准曲线在492 nm处测各孔A值，由此绘制标准曲线（Fig 2）并拟合线性回归方程为： A=0.0042C+0.0154，r=0.9996 （P<0.001），bFGF在0~500 ng/L范围内符合线性关系.

　　2.3缓释微球中bFGF的含量在492 nm处测定得A值，根据回归方程计算出相应bFGF含量. 缓释微球中bFGF质量为4.841 μg，由此得出微球平均载药率为0.24%，平均包裹率为96.82%（n=5）.

　　2.4缓释微球体外溶出度测定由缓释微球体外释放样品各个时间点的A值得出的bFGF浓度，并由此绘制出微球体外累积释放量曲线（Fig 3）.A: Blank; B: bFGFimpregnated.

　　3讨论

　　bFGF是一类具有较高活性的多聚肽，对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛的生物学活性，可改变一些细胞的趋化性，诱导或抑制特殊蛋白质的合成或分泌［3］. 但由于这种多功能细胞因子半衰期短，易失去活性,应用效果不甚理想. 我们设计的缓释微球可缓释药物、靶向输送、保证药物的治疗作用的前提下减少给药剂量以及降低药物毒性等［4］. 通过含量测定，缓释微球对bFGF的包裹率可达96.82%. 体外证实，复合bFGF缓释微球在7 d内对上皮细胞仍有促进增殖活性［5］. bFGF的累积释放量呈缓慢上升趋势， d 1累积释放率为28.23%，不存在初始阶段的“突释”现象［6］；2~5 d，累积释放量率57.19%,克服了部分同类产品释放药物时初期浓度过大，短期内又迅速降低现象;到7 d时，累积释放率达到93.94%，虽然释放速率减慢，但体外仍有bFGF生物活性.

　　本实验对缓释载体的研制尚处于实验室阶段，但由于此种缓释微球性能优良，可以根据组织工程化产品应用的不同需要，生产出包裹其他药物的缓释微球，也可同时包裹几种生长因子发挥联合调控的作用. 本设计工艺简便，能较长时间持续释放活性生长因子，在组织工程研究领域具有广阔的应用前景.

　　【参考文献】

　　［1］ Richardson TP，Peters MC．Polymeric system for dual growth factor delivery［J］．Nat Biotechnol, 2001;19(9)：1029-1034.

　　［2］ Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，et al. Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factorimpregnated gelatin microspheres into artificial dermis ［J］. Biomaterial，2000;21：489-499.

　　［3］ Kinsella L，Chen HL，Smith JA，et al．Interactions of putative heparinbinding domains of basic fibroblast growth factor and its receptor，FGFR1，with heparin using synthetic peptides［J］．Glycoconj J，1998；15：419-422．

　　［4］ Maysinger D， Krieglstein K， Filipovic J，et al． Microencapsulated ciliary neurotrophic factor：Physical properties and biological activities［J］． Exp Neurol， 1996；138：177-l88．

　　［5］ 黄沙，金岩, 吴红. 制备复合生长因子的缓释微球并考察其对细胞的影响［J］. 上海生物医学工程,2004；25（4）：22-25.

　　Huang S, Jin Y,  Wu H. Preparation and cell effect test of bFGFimpregnanted microspheres［J］. Shanghai Biomed Eng,2004；25（4）：22-25.

　　［6］ Edelman ER，Mathiowitz E, langer R, et al. Controlled and modulated release of basic fibroblast growth factor［J］．Biomaterial,1991；12:619-626.