【摘要】  目的： 研究单核细胞趋化蛋白?1（MCP?1）对人脐静脉内皮细胞(hUVEC)凋亡的影响. 方法：培养并鉴定hUVEC；用不同浓度MCP?1（0.1, 1.0, 10, 100 μg/L）对其作用24，48 h；Annexin V/PI双染细胞，流式细胞仪观察内皮细胞凋亡；琼脂糖凝胶电泳检测细胞染色体“DNA ladder”的形成. 结果： MCP?1能诱导hUVEC的凋亡，其效应随浓度和时间的增加而增强(P<0.01)； Annexin V/PI显示凋亡细胞明显增加；细胞DNA呈明显的“DNA ladder”. 结论： MCP?1能诱导hUVEC凋亡.

【关键词】  单核细胞化学吸引蛋白质?1；脐静脉；内皮细胞；动脉硬化；细胞凋亡

　　动脉粥样硬化 (As)与血管内皮细胞（VEC）之间的关系密切，目前被普遍接受的“损伤反应” 学说［1］认为，内皮细胞功能性的损伤是As形成早期的始动环节. 有学者认为内皮细胞的凋亡在As的早期扮演了重要角色［2］. 单核细胞趋化蛋白1（MCP?1）是一种趋化激活剂，可以特异地作用于血液中的单核细胞，招引其迁移至内皮下形成泡沫细胞. Selzman等［3］及官秀梅等［4］的研究发现，MCP?1不仅有趋化作用，而且可以作为一种生长因子促进血管平滑肌细胞的增殖，从而直接或间接地参与了As的形成，但MCP?1对与As发生关系极为密切的内皮细胞的生长有何影响尚少见相关报道，我们对此进行了研究.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人MCP1（Peprotech公司）；M199培养基，胎牛血清（Gibco公司）；胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶，EDTA（Sigma公司）；Annexin V?EGFP 细胞凋亡检测试剂盒，DNA ladder 检测试剂盒（Oncogene公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2(KDR)抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；CO2孵箱（美国Thermo Formo公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像系统（英国Syngene公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1人脐静脉内皮细胞（hUVEC）培养

　　采用李琴山等［5］改良的酶消化法进行细胞培养，用内皮细胞特异性Ⅷ因子抗体（抗von Willebrand因子抗体）以及KDR mAb免疫细胞化学法鉴定内皮细胞. 本实验所用细胞均为第3代.

　　1.2.2实验分组

　　将细胞分为5组. 阴性对照组：含10 mL/L胎牛血清的M199培养基，2 mmol/L L?谷氨酰胺；实验组（M1~M4组）：MCP?1含量分别为0.1，1.0，10，100 μg /L.

　　1.2.3Annexin V/PI双染流式细胞仪检测

　　早期凋亡率将hUVEC以1×106个/瓶接种于50 mL无菌的培养瓶中，孵育24 h后用含10 mL/L胎牛血清的M199同步化12 h后换为不同终浓度的MCP?1应用液，24，48 h后用流式细胞仪检测早期凋亡率.

　　1.2.4琼脂糖凝胶电泳检测

　　DNA ladder将hUVEC以1×106个/瓶接种于50 mL无菌的培养瓶中，孵育24 h后用含10 mL/L胎牛血清的M199同步化12 h后换为不同终浓度的MCP?1应用液，24，48 h后按试剂盒说明书提取DNA，15 g/L琼脂糖凝胶电泳. 电压5 V/cm ，电泳2.5 h. 在凝胶成像系统上观察结果并拍照.

　　统计学处理： 所有数据用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析及t检验，结果用x±s表示.

　　2结果

　　2.1细胞培养与鉴定

　　培养的细胞在显微镜下观察，细胞呈典型的“铺路石”样结构特征（图1）. Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色. GAM?FITC绿色荧光显示膜上KDR（Anti?VEGF recepter?2）  和GAR?TR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子，免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞. 证明所培养的细胞为血管内皮细胞，并且纯度符合实验要求.

　　2.2Annexin V/PI双染流式细胞仪分析

　　在0.1 μg/L MCP?1作用VEC 24 h即可明显诱导hUVEC的早期凋亡，这种效应随MCP?1用量增加和作用时间的延长而明显增强（P<0.01，表1）. 表1不同浓度的MCP?1作用hUVEC 24，48 h后Annexin V/PI检测早期凋亡（略）

　　2.3MCP1对hUVEC作用

　　后琼脂糖凝胶电泳在1.0  μg/L的MCP?1作用24，48 h时均未见“DNA ladder”，而10 μg/L和100 μg/L的MCP?1作用于hUVEC 24，48 h后均可见“DNA ladder”（图2）. 说明MCP1作用于hUVEC可引起凋亡，并且具有剂量依赖性.

　　3讨论

　　血管内皮细胞是参与As病理过程的重要细胞，实验证明发生As的局部血管内皮细胞更新加快，提示高频率的内皮细胞凋亡是As发生的第一步［6］，信捷职称论文写作发表网，凋亡内皮细胞的增加易改变内皮的完整性和功能，从而诱发As［7-8］. 因此VEC凋亡在As中的作用越来越受到关注. MCP?1为一种趋化激活剂，在As斑快中有很高的表达，已证实多种促进As的刺激因素均可引起MCP?1的高表达［9］. 新的研究发现，MCP?1不仅是趋化激活剂，参与了As及多种炎性疾病的发生，而且可以作为一种生长因子促进VSMC的增殖，从而直接或间接地参与了As的形成.

 　　我们用不同浓度MCP1作用于原代培养的hUVEC（来源于人体、更接近于体内细胞的生理特性）24，48 h，观察其对VEC生长的影响. 细胞发生凋亡时，由于内源性钙－镁离子依赖性核酸內切酶被激活，选择性降解核小体间DNA，形成大小不一的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现规则的、间隔180～200 bp的DNA梯带，即“DNA ladder”, 而坏死细胞DNA断裂无规律性. “DNA ladder”已被认为是判定细胞凋亡的金标准之一［10］. 此外，细胞发生凋亡时胞膜成分亦发生改变. 在凋亡早期,原来位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)迁移至脂双层外侧，PS外翻是凋亡细胞的早期事件. Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合. 与PI双染细胞通过流式细胞仪可区分活细胞、凋亡细胞及坏死细胞. 两项指标检测的结果均表明MCP?1 能够诱导hUVEC的凋亡，但对细胞坏死没有影响. 并且MCP?1的这种促hUVEC凋亡的效应随着其浓度和时间的增加而增强. 在As发病中多种因素可刺激MCP1表达增加，MCP?1可通过诱导 hUVEC的凋亡加重As病变，这从一个新的角度探讨了MCP?1致As的机制，对认识MCP?1的多种生物学功能有重要意义.

【参考文献】
  　　［1］Olivier T, Ziad M, Christophe H, et al. Relation between endothelial cell apoptosis and blood flow direction in human atherosclerotic plaques ［J］. Circulation, 2000,101(15):2450-2453.

　　［2］Haunstetter A, Izumo S. Apoptosis: Basic mechanisms and implications for cardiovascular disease ［J］. Circ Res, 1998,82(21):1111-1120.

　　［3］Selzman CH, Miller SA, Zimmerman MA, et al. Monocyte chemotactic protein?1 directly induces human vascular smooth muscle proliferation ［J］. Physiol Heart Circ Physiol, 2002,283(4):H1455-1461.

　　［4］官秀梅，钱民章. 单核细胞趋化蛋白?1对人脐静脉平滑肌细胞增殖的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2005，13（3）：309-312.

　　［5］李琴山，冯赞杰，刘 洋，等. 一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法 ［J］.第四军医大学学报，2007，28（3）：276-278.

　　［6］Dimmeler S, Hermann C, Zeiher AM, et al. Apoptosis of endothelial cells: contribution to the pathophysiology of atherosclerosis［J］. Eur Cytokine Netw,1998,9(11):697-698.

　　［7］Choy JC, Granville DJ, Hunt DW, et al. Endothelial cell apoptosis: Biochemical characteristics and potential implications for atherosclerosis ［J］. Mol Cell Cardiol, 2001， 33(9):1673-1690.

　　［8］Schepers A, Eefting D, Bonta PI, et al. Anti?MCP?1 gene therapy inhibits vascular smooth muscle cells proliferation and attenuates vein graft thickening both In vitro and in vivo ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26（34）: 2063-2069.

　　［9］Takaishi H, Taniguchi T, Takahashi A, et al. High glucose accelerates MCP?1 production via p38 MAPK in vascular endothelial cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun,2003,305(1):122-128.

　　［10］Cathleen C, Abdellah M, Tamara R, et al. Peroxynitrite?induced mitochondrial and endonuclease?mediated nuclear DNA damage in acetaminophen hepatotoxicity ［J］. Pharmacol Exp Ther, 2005，315(17): 879-887.