这是一篇药用植物代谢组学的内容，代谢组学正日益成为研究的热点，越来越多的人已加入到代谢组学的研究中。随着代谢组学积累的数据和信息量的增大，其在药用植物学各个领域的应用价值也与日俱增。

　　【摘要】 从技术步骤、剖析办法以及实践使用三个方面对以后药用动物代谢组学研讨范畴的一些实际成绩和理论中面临的应战停止综述。

　　【关键词】 药用动物;代谢组学;功用基因组学

　　代谢组学是对生物体内代谢物停止大规模剖析的一项技术[1]，它是零碎生物学的重要组成局部(如图1所示)，药用动物代谢组学次要研讨外界要素变化对动物所形成的影响，如气候变化、养分胁迫、生物胁迫，以及基因的渐变和重组等惹起的巨大变化，是物种表型剖析最强无力的工具之一。在古代中药研讨中，代谢组学在药物无效性和平安性、中药资源和质量控制研讨等方面具有重要实际意义和使用价值。另外，在对形式动物渐变体文库或转基因文库停止剖析之前，代谢组学往往是首先思索采用的研讨办法之一。目前，国外已有成功应用代谢组学技术对拟南芥渐变株停止大规模基因挑选的例子，这爲与重要性状相关基因功用的说明和选育可供商业化应用的转基因作物奠定了根底。

　　目前，还有许多经济作物的全基因组测序方案尚未完成，由于代谢组学研讨并不要求对基因组信息的理解，所以在与这些作物有关的研讨范畴具有更大的应用价值，这也是其与转录组学和蛋白组学研讨相比的劣势之一。代谢组学研讨触及与生物技术、剖析化学、无机化学、化学计量学和信息学相关的少量知识，Fiehn[2]对代谢组学有关的研讨方向停止了分类(见表1)。

　　一、代谢组学研讨的技术步骤

　　代谢组学研讨触及的技术步骤次要包括动物栽培、样本制备、衍生化、别离纯化和数据剖析5个方面(见图2)。

　　1.1动物栽培

　　对研讨对象停止培育的目的是爲了对样本的波动性停止控制，绝对于微生物和植物而言，动物的人工栽培需求考

　　虑更多的成绩，如中药材在不同年龄、不同发育阶段、不同部位以及光照、水肥、耕作等环境要素的巨大差别都可惹起生理形态的变化，而这些非可控及可控双重要素的影响很难停止准确的控制，从而影响药用动物代谢组研讨的反复性。爲理解决以上成绩，引荐运用大容量的培育箱[3]，定时改换培育箱中栽培对象的地位，以及运用无土栽培技术等，Fukusaki E[4]应用无土栽培零碎将水和营养间接引入动物根部，并且对供应量停止准确地控制，大大进步了实验的反复性。

　　1.2样本制备

　　爲了取得波动的实验后果，样本制备需求思索样本的生长、取样的工夫和地点、取样量以及样本的处置办法等成绩，并依据剖析对象的分子构造、溶解性、极性等理化性质及其绝对含量大小对提取和别离的办法停止选择，逐一优化实验方案。Maharjan RP等[5]用6种办法辨别对大肠杆菌中代谢产物停止提取，发现用-40℃甲醇停止提取的效果最好。现阶段代谢组学的剖析对象次要集中在亲水性小分子，尤其是初级代谢产物，气相色谱?质谱联用(GC?MS)和毛细管电泳?质谱(CE?MS)联用都是剖析亲水小分子的重要技术。Fiehn O等[6]运用GC?MS对拟南芥叶片中的亲水小分子停止了剖析，发现酒石酸半缩醛、柠苹酸、别苏氨酸、羟基乙酸等15种动物代谢物。

　　1.3衍生化处置

　　对目的代谢产物的衍生化处置取决于所运用的剖析设备，GC?MS零碎只合适对挥发性成分停止剖析，高效液相色谱法(HPLC)普通则运用紫外或荧光标志的办法对样本停止衍生处置，Blau K[7]对酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化和离子化等衍生办法停止了详细的阐明。但是离子化抑制常使得质谱剖析进程中目的代谢产物的离子化效率降低，这次要是由于别离进程中净化物与目的代谢物难以完全别离开所惹起的，优化色谱别离工夫可无效缓解离子化抑制，但是在实践操作中不能够对上百种代谢产物的别离工夫停止优化，应用非放射性同位素浓缩法停止绝对定量可以很好的处理该成绩。Han DK等[8]使用同位素编码的亲和标志(ICAT)，依据经诱导分化的微粒蛋白及其同位素标志物的峰面积比，对该蛋白的绝对含量停止剖析。Zhang R等[9]发现同位素标志技术也可用于代谢组学的研讨，但是却存在许多困难。活体的同位素标志办法关于同位素的洗脱是一种十分有潜力的技术，目前关于运用34 s的研讨已有报道[10]。

　　1.4别离和定量

　　别离是代谢组学研讨中的重要步骤，与质谱联用的色谱和电泳剖析技术都是运用紫外或电化学检测的办法停止定量，其对代谢组数据的分辨率与定量才能都有一定的影响。Tomita M等[11]总结了各种色谱别离法中常常遇到的技术成绩，以为毛细管电泳和气相色谱法由于具有较高的分辨率，已成爲代谢组学研讨的惯例技术手腕之一，液相色谱因其适用范围广，使用也相当普遍。

　　Tanaka N等[12]用高效液相色谱对样品停止别离，以为运用硅胶基质填充毛细管全体柱的高效液相色谱零碎具有用量少、灵敏性高、高压降高速别离等劣势;同时，Tolstikov V等[13]也运用硅胶填充的毛细管液相色谱办法对聚戊烯醇类异构体停止了无效别离，取得了很好的分辨率。Tanaka N等[14]发现二维毛细管液相色谱法的分辨率比传统的高效液相法高10倍。绝对于其他色谱办法而言，超临界流体色谱(SFC)是别离疏水代谢物最具潜力的技术之一，特别适用于别离那些传统HPLC难以剖析的疏水聚合物，Bamba T等[15]经过SFC对聚戊烯醇停止剖析，证明其具有较好的别离才能。针对质谱中存在的共洗脱景象，Halket JM等[16]创造了一种适用于GC?MS的反褶积零碎，对共洗脱的代谢产物停止别离与辨认。Aharoni A等[17]运用傅立叶变换离子盘旋共振质谱(FT?ICR?MS)对非目的代谢物停止剖析，疾速扫描动物渐变样品，取得了一定量的代谢成分。

　　与别离一样，定量才能也是代谢组学研讨中的重要要素，其取决于各剖析零碎的线性范围。傅立叶转换核磁共振(FT?NMR)、傅立叶红外光谱(FT?IR)以及近场红外光谱法(NIR)等技术由于敏理性低，反复性受共洗脱景象影响较小也被用于检测中。近年来，FT?NMR技术常被用于动物代谢组的指纹图谱研讨 [18]，但由于NMR剖析需求样品量较大，剖析后果易受净化，Griffin J L [19]发现将统计形式辨认与FT?NMR相结合可以对代谢物停止片面剖析。除FT?NMR之外，FT?IR经过对无机成分的构造停止惯例光谱测定，也可适用于代谢组学的研讨，特别是使用于构建代谢组学的指纹图谱。虽然它不能对代谢物停止片面剖析，但对具有特定功用的组分却有很好的定量效果，对从工业及食品原资料中别离的代谢混合物也可以停止片面剖析，目前，已有学者将其成功地使用于拟南芥[20]和番茄[21]代谢产物指纹图谱的研讨中。

　　1.5数据转换

　　爲说明代谢物复杂的线性或非线性关系，需求停止多变量剖析，将原始的色谱图数据转换爲数字化的矩阵数据，经过对色谱峰鉴定和整合从而停止多变量剖析。由于环境等要素的搅扰，光谱数据需求经过适当的数据加工办法停止校正，包括：①降低噪声;②校正基线;③进步分辨率;④数据规范化。Jonsson P等 [22]报道了一种关于GC?MS色谱图数据处置的办法，可以对少量代谢产物样品停止无效的辨认。

　　二、代谢组学中的数据剖析办法

　　2.1主成分剖析法(PCA)

　　主成分剖析法，将实测的多个目标用多数几个潜在的互相独立的主成分目标线性组合来表示，反映原始测量目标的次要信息。使得剖析与评价目标变量时可以找出主导要素，切断其他相关要素的搅扰，作出更爲精确的估量与评价。PCA数据矩阵通常来自于GC?MS，LC?MS 或CE?MS，因而将目的代谢产物作爲自变量，而相应的代谢产物含量作爲因变量，定义与最大特征值方向分歧的特征向量爲第一主成分，依此类推，PCA便能经过对几个次要成分的剖析，从代谢组中辨认出无效信息。主成分剖析有助于简化剖析和多维数据的可视化，但是该办法能够招致一局部有用信息的丧失。

　　2.2层次聚类剖析法(HCA)

　　层次聚类剖析法也常用于代谢组学的研讨中，它是将n个样品分类，计算两两之间的间隔，构成间隔矩阵，兼并间隔最近的两类爲一新类，计算新类与以后各类的间隔。再兼并、计算，直至只要一类爲止。停止层次聚类前首先要计算类似度(similarity)，然后运用最短间隔法(Nearest Neighbor)、最长间隔法(Furthest Neighbor)、类间均匀链锁法(Between?groups Linkage)或类内均匀链锁法(Within?groups Linkage)四种办法计算类与类之间的间隔。该办法虽然准确，但计算机数据密集，对少量数据点停止剖析时，更合适选用K?均值聚类法(KMC)或批次自组织映射图法(BL?SOM)，而HCA合适将数据转换爲主成分后运用。

　　2.3自组织映射图法(SOM)

　　神经网络中临近的各个神经元经过侧向交互作用互相竞争，开展成检测不同信号的特殊检测器，这就是自组织特征映射的含义。其根本原理是将多维数据输出爲几何学节点，类似的数据形式聚成节点，相隔较近的节点组成相邻的类，从而使多维的数据形式聚成二维节点的自组织映射图。除PCA和HCA外，SOM异样也可使用于包括基因组和转录组等组学研讨中 [23]。最后SOM计算工夫长，依托数据输出顺序决议聚类后果，近年来SOM逐步开展成爲不受数据录入顺序影响的批次自组织映射图法(BL?SOM)。由于BL?SOM可以对类停止调整，且有明白的分类规范，优化次第优于其他聚类法，已在基因组学和转录组学数据剖析中失掉普遍的使用。

　　2.4其他数据采矿办法

　　除PCA、HCA和SOM外，很多变量剖析办法都可用于动物代谢组学的剖析。软独立建模分类法(SIMCA)是应用主成分模型对未知样品停止分类和预测，合适对少量样本停止剖析;近邻分类法(KNN)和K均匀值聚类剖析法(KMN)也可用于样品分类;主成分回归法(PCR)或偏最小二乘回归法(PLS)在某些状况下也可运用。但是到目前爲止由于还没有树立一个规范的数据剖析办法，代谢组学依然是一门有待完善的学科。

　　三、代谢组学在药用动物中的理论

　　动物药材来源于药用动物体，而药用动物体的形状建成是其体内一系列生理、生化代谢活动的后果。动物代谢活动分爲初生代谢和次生代谢，初生代谢在动物生命进程中一直都在发作，其经过光协作用、柠檬酸循环等途径，爲次生代谢的发作提供能量和一些小分子化合物原料。次生代谢往往发作在动物生命进程中的某一阶段，其次要生物分解途径有莽草酸途径、多酮途径和甲瓦龙酸途径等。动物药材含有的生物碱、胺类、萜类、黄酮类、醌类、皂苷、强心苷等活性物质的绝大少数属于次生代谢产物，因而讨论次生代谢产物在药用动物体内的分解积聚机制及其影响要素，关于进步活性物质含量、保证药材质量、波动临床疗效等具有重要意义。孙视等[24]经过对银杏叶中黄酮类成分积聚规律的研讨，提出了选择具有一定环境压力的次适合生态环境处理药用动物栽培中生长和次消费物积聚的矛盾。王昆等[25]以人参叶组织爲资料,总结了构建人参叶cDNA文库进程中存在的一些关键成绩和应采取的对策,爲今后关于人参无效成分如人参皂苷的生物分解途径及其调控的根底研讨提供技术参考和实际指点。最近，美国加利福尼亚大学伯克利分校的Keasling等[26]采用一系列的转基因调控办法，经过基因工程酵母分解了青蒿素的前体物质——青蒿酸，其产量超越100 mg/L，爲无效降低抗疟药物的本钱提供了机遇。经过临时的研讨积聚，人们对代谢途径的主干局部(爲次生代谢提供底物的初生代谢途径)曾经根本理解，例如酚类的莽草酸途径， 萜类的异戊二烯二磷酸(IPP)途径等。被子动物中一些绝对激进的次生代谢途径也失掉了很好的研讨，如黄酮类、木质素的生物分解与调控。但是，对次生代谢最丰厚最神奇的局部——特定产物分解与积聚的进程，还所知甚少[27]。

　　四、展 望