论文关键词 青霉素结合蛋白苯唑西林 亲和力

　　论文摘要 利用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光放射自显影术及竞争分析法检测苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白的亲和力。结果发现金葡球菌有5条青霉素结合蛋白,即PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5,分子量范围41~87kD。苯唑西林主要与金葡球菌ATCC25923的PBP1和PBP2亲和力强,尤其是与PBP2亲和力很强。由此说明金葡球菌的PBP1和PBP2是苯唑西林的主要作用靶位。

　　青霉素结合蛋白(penicillin-bindingproteins,PBPs)是存在于细菌细胞内膜上一群能同青霉素和其他β-内酰胺类抗生素螯合的细菌蛋白质,即是抗生素作用的靶位点,抗生素与这些靶位点结合后,干扰细菌细胞壁肽聚糖合成而导致细菌细胞溶解死亡。苯唑西林(oxacillin)对金葡球菌具有强大的抗菌作用,对其作用机制的研究,国内未见报道。本文应用微生物生化研究方法,从金葡球菌标准株ATCC25923中提取细菌内膜蛋白,采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、荧光放射自显影术及竞争分析法,研究了苯唑西林与金葡球菌标准株ATCC25923细胞内膜青霉素结合蛋白的亲和力,探讨苯唑西林杀菌作用的分子学基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 药品及试剂

　　苯唑西林为国家暂行标准品,910u/mg;溶葡萄球菌素(lysostaphin)为Sigma公司产品; Bq/mmol,英国Amersham同位素公司产品;十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺和Triton X-100, 为Sigma公司产品;PPO(2,5-diphenyl-oxa-zol),瑞士Fluka公司产品;二甲基亚砜(DMSO),重庆化学试剂厂产品;X光片为美国Kodak公司产品。

　　1.2 实验仪器

　　超声粉碎机(Virsonic 300型),美国Vir-tis公司产品;超速低温离心机Beckman L8-60,美国Beckman公司产品;直立式电泳仪,北京六一仪器厂生产;凝胶吸干器(gel slabdryer),英国Bio-Rad公司产品。

　　1.3 菌株

　　金葡球菌标准株ATCC25923,获自中国科学院菌种保存中心。

　　1.4 研究方法

　　1.4.1 增菌

　　将金葡球菌接种于M-H肉汤(pH7.2)25ml中,37℃恒温振荡(速度150~200r/min)孵育16h,再转移至250ml新鲜预热的M-H肉汤中继续振荡4h。于10℃,8000×g离心10min收集菌体,用50mmol/L PBS(pH7.0)洗涤1次,称湿菌量可达1~2g。

　　1.4.2 细菌细胞内膜蛋白质的制备

　　参照文献[1]并作改进。将湿菌悬于2倍体积的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5,含10mmol/L MgCl2、0.14mol/Lβ-巯基乙醇、0.5mg/L DNaseⅠ、300mg/L溶菌酶、25mg/L溶葡萄球菌素),37℃,孵育30~60min,然后在冰浴中进行超声粉碎(60s破碎+60s间隔,强度14kHz,共6次),在显微镜下观察细胞破裂情况。7000×g,4℃,离心10min去除未破碎细胞。上清液于100000×g,4℃,离心50min使细胞膜沉淀,沉淀物用400~500μl PBS(pH7.0,含1mol/L NaCl,2% Triton X-100,1mmol/Lβ-巯基乙醇)混匀,放0℃30min,于45000×g,4℃,离心35min,上清液(含细菌内膜蛋白)采用Lowry法[2]测定其蛋白质含量,调节蛋白质浓度为10g/L,分装后放-70℃备用。

　　1.4.3 苯唑西林与-青霉素G竞争性结合

　　参照文献[3]并有改进。在一系列新鲜配制的苯唑西林溶液(0,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,32,128mg/L)10μl/管中加入膜蛋白20μl(200μg蛋白质)混匀,37℃,孵育10min,然后加入10μl(3.7×104Bq)14C-青霉素G钾继续育10min,最后加入10μl终止缓冲液(3.8%Tris,10%SDS,0.005%溴酚蓝,50%甘油(V/V),25%β-巯基乙醇(V/V),pH7.0)终止反应,煮沸5min,待冷却后作短暂离心,经电泳分离蛋白质。

　　1.4.4  SDS—PAGE

　　使用不连续的垂直电泳法,10%分离胶,5%浓缩胶,每孔加样50μl,电压75~120V,电流20~30mA,电泳4~6h(即溴酚蓝移至距底部约1cm处),凝胶用0.25%考马斯亮蓝R-250染色4h以上,然后用90%甲醇与10%冰乙酸脱色数次。

　　1.4.5 荧光放射自显影(Fluorography)

　　参照文献[4],将脱色的凝胶浸泡于相当于其20倍体积的二甲基亚砜(DMSO)中,1h后更换新鲜的DMSO再浸泡1h。然后凝胶浸泡于相当其5倍体积的22.2% PPO/DMSO中3h,继之置凝胶于蒸馏水中浸泡3h及含10%冰乙酸、1%甘油溶液中浸泡45 min。经凝胶干燥器进行真空干燥。将X光片进行预曝光,其目的是校正样品的放射量与X光片呈现影象的非线性关系。预曝光剂量X线电压40kV,电流50mA,距光源距离50 cm,曝光时间0.02s,即使X光片影象强度增加0.25左右。干燥的凝胶与经预曝光的X光片紧密接触,-50℃低温下曝光50~60d。曝光后的X光片在Kodak X光冲洗机中进行显影、定影处理。

　　1.4.6 最低抑菌浓度(MIC)

　　采用试管二倍稀释法,37℃,孵育16~18h后观察结果,以肉眼观察无细菌生长的最低浓度为MIC。