作者：唐省三,马亚珍,刘红云,朱晓琴,雷水生

【关键词】  再灌注损伤

    Changes of nitric oxide synthesis in cardiac ischemia reperfusion injury
 
　　【Abstract】 AIM: To investigate the expression and function of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) during ischemiareperfusion injury (IRI) in rat hearts. METHODS:  IRI was induced by clamping the left anterior descending (LAD) of coronary artery for 1h, followed by reperfusion. Nitric oxide synthase (NOS) activities of hearts was assayed at various time points and NOS protein levels as well as NOS mRNA expression were determined by Western blot and RTPCR methods respectively. RESULTS:  eNOS activity, protein level and mRNA expression all increased after 26 h of IRI and decreased after 3 d of IRI and then gradually returned to basal level after 21 d. iNOS was expressed after 12 h of IRI and reached the peak level at day 3 after IRI and then decreased to basal level. CONCLUSION:  The expression of iNOS is high while that of eNOS is low during cardiac ischemiareperfusion injury. Proper regulation of eNOS and iNOS expression may be therapeutically helpful in treating patients with cardiac ischemiareperfusion injury.

　　【Keywords】　reperfusion injury; nitric oxide synthase; heart

　　【摘要】 目的： 研究大鼠心脏缺血再灌注损伤(IRI)过程中一氧化氮合酶(NOS) 的变化规律及其作用. 方法： 制作SD大鼠心脏IRI动物模型,用同位素法测定正常及IRI心组织的NOS活性；用Western印迹和逆转录PCR法分析eNOS和iNOS 在IRI过程中蛋白和基因表达的变化.结果： 心脏eNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注2~6 h后均增高，3天后降低，21天后逐渐恢复到正常水平. 心脏iNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注12 h后开始表达，3天达高峰，然后逐渐降至正常水平. 结论： 单纯缺血并不引起NOS 活性的明显变化,再灌注损伤使NOS的mRNA表达增加,酶的合成增多,活性增高.

　　【关键词】　再灌注损伤；一氧化氮合酶；心脏
　
　　0引言

　　一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起着极其重要的作用［1］.一氧化氮合酶(nitric oxide synthesis, NOS) 可分为原生型(cNOS) 和诱生型(iNOS) .cNOS 依存在的部位分为神经型(nNOS) 和内皮型(eNOS).心脏组织内的NOS同功酶有两种,即eNOS和iNOS. 参与炎性反应及急性排斥反应等病理过程［2］. 我们研究eNOS和iNOS在心脏IRI中的变化规律及其作用,为其防治提供理论基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　SD大鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；iNOS Assay Kit 购自南京建成生物技术研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOS mAb 购自武汉博士德公司； HRP标记的兔抗羊IgG二抗购自Sigma 公司； Trizol裂解液、Oligo(dT) 、TaqDNA聚合酶和逆转录酶(AMV RT)均为美国Gibco 公司产品；eNOS和iNOS 引物及内参照由上海博亚生物技术公司合成. 冠状动脉阻断再灌注模型制备［3］后在不同的再灌注时间点处死大鼠,收集心脏标本,液氮急冻, -70℃保存备用.

　　1.2方法

　　取雄性200～220 g SD大鼠120只,随机分为缺血再灌注（IRI）组和假手术（对照,Control）组，每组60只，在再灌注不同时间点（0, 0.5, 1, 2, 6, 12 h和1, 3, 7, 14, 21, 30 d ）处死大鼠，每组每个时间点各5只.

　　1.2.1NOS活性的测定IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2 g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2 g,采用iNOS Assay Kit进行测定. 心组织NOS活性的测定采用3［H］精氨酸同位素法［4］ , 心组织在4℃含有1 mmol/L leupeptin, 2 mmol/L aprotonin, 1 mmol/L　phenylemthylsulfonyl fluoride, 1 mmol/L DTT, 1 ml/L Triton X100的30 mmol/L HEPES缓冲液中匀浆,反应液为30 mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4),含1 mmol/L CaCl2, 100 mmol/L NADPH, 300 mmol/L tetrahydrobiopterin, 1 mmol/L dithiothreitol,以40 mmol/L L3H精氨酸(37 kBq/反应液)为反应底物,在37℃下反应30 min,用200 μL 含100 mmol/L EGTA的终止液终止反应,反应体系过5 cm的Dowex离子交换层析柱,加闪烁液后读取放射性记数. 蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.
1.2.2Western印记检测iNOS和eNOS蛋白表达IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2 g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2 g,以5∶1(V/m)比例置匀浆缓冲液（含50 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 5 g/L αcholate sodium, 1 g/L SDS, 2 mmol/L EDTA, 10 g/L Triton X100,100 mL/L甘油，1 mmol/L PMSF, 2 mg/L aprotinin）匀浆破碎组织. 匀浆液于4℃ 10 000 g离心15 min，收集上清液并用dyebinding (BioRad)方法以牛血清清蛋白为标准测定蛋白浓度. 取含30 mg总蛋白的各组标本匀浆上清液点样进行75 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离Mr 135 000的iNOS及150 000的eNOS蛋白. Mr标准采用预染的彩虹重组蛋白(Amersham International plc, Buckinghamshire, England). 电泳后的凝胶通过Western印记装置（BioRad）电转移蛋白质至hybond C膜(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England).转移膜经封闭、与1∶500稀释的iNOS或eNOS mAb 4℃孵育过夜、洗涤、与1∶5000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG室温孵育1 h和第2次洗涤，最后用ECL Western印记荧光检测系统(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) 显色、曝光于X光底片(Fuji, Tokyo, Japan)和显影、定影.将感光X 光片上蛋白条带应用HPIAS 2000 型图像分析系统(同济千屏影像工程公司生产) 扫描测定光密度(OD) 定量.

　　1.2.3RT PCR检测iNOS和eNOS的转录IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2 g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2 g,采用Trizol试剂提取总RNA，以thermoscriptTM RTPCR系统进行逆转录和PCR反应. PCR反应采取等量逆转录cDNA模板，分别以iNOS, eNOS, βactin特异性引物进行PCR反应. 扩增iNOS的引物对为：  sense： 5′TGGCTTGCCCTTGGAAGTTT
CTC3′, antisense:  5′TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA3′，预计扩增产物为574 bp iNOS cDNA片段，PCR反应条件为95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min. 扩增eNOS的引物对为： sense: 5′TACGGAGCAGCAAATCCAC3′, antisense: 5′CAGGCTGCAGTCCTTTGATC3′，预计扩增产物812 bp，PCR反应条件为95℃ 5 min；95℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 1.25 min，共30个循环；72℃ 10 min. 内对照βactin的扩增引物对为： sense:  5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,  antisense: 5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，预计产物为540 bp， PCR反应条件为95℃ 2 min； 95℃ 30 s， 60℃ 45 s，信捷职称论文写作发表网， 72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min. PCR产物以含0.5 mg/L溴乙锭的10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光照下观察电泳条带,用BioRad凝胶分析系统分析结果，结果以光密度值（OD）表示.

　　统计学处理:　数据均以x±s表示. 应用SPSS11.0软件进行方差分析, P<0.05为有显著性差异.

　　2结果

　　2.1心脏IRI时NOS活性的变化单纯缺血1 h，心脏NOS活性与对照组相比无明显变化.心脏恢复血供再灌注0.5 h后cNOS活性即开始升高, 以2～6 h最高, 与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01) ；但12 h后却迅速下降,3 d时活性最低与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01),以后逐