2.2Western印迹IRI组再灌注0.5 h后心脏eNOS蛋白质表达即开始升高,2 h达到高峰,12 h后开始减少,3 d时为最低,以后逐渐恢复,21 d时恢复至对照组水平,与NOS活性变化相一致.对照组心脏检测出iNOS蛋白微量表达,但表达量远低于eNOS, IRI可诱导其表达,在12 h后表达逐渐增强,3 d时表达最强,随后逐渐减弱,21 d时恢复对照组水平,也与iNOS的活性变化相一致(Fig 1, Tab 2).表2Western印迹法测定心脏IRI 后eNOS 和iNOS 蛋白表达(略)
2.3NOS mRNA的基因表达IRI组心脏再灌注早期(0.5～12 h) 即可诱导eNOS mRNA表达增强,2 h达高峰,此后随着损伤程度加重,其表达迅速下降. 3 d低于对照组,以后逐步恢复,21 d已相当对照组水平. 在对照组心脏iNOS mRNA表达微弱,再灌注12 h后开始增强,3 d达高峰,21 d恢复正常水平(Fig 2, Tab 3) .以上eNOS和iNOS mRNA的消长变化与蛋白质的表达和酶活力的变化一致.表3大鼠心脏IRI后eNOS和iNOS mRNA半定量结果(略)
3讨论
eNOS来源的NO具有舒张心血管,抑制白细胞浸润和血小板的凝聚作用［5］，从而对心脏可能起到保护作用. Song等［6］的研究表明,在早期eNOS的过量表达对小鼠骨骼肌的IRI具有保护作用,随着损伤过程的进展, 心脏结构和功能的损害不断加重,eNOS表达也相应迅速下降.这可能由于大量心肌细胞坏死和凋亡,导致eNOS的合成减少有关. eNOS的表达随着心脏损伤修复和心功能的恢复逐步恢复. NO在心肌再灌注损伤中加重心肌损害. 缺血再灌注情况下,多种细胞因子上调巨噬细胞等内的iNOS的mRNA表达,立即产生大量的iNOS和NO. 过量的NO与氧迅速反应生成大量的氧自由基如过氧亚硝酸阴离子(ONOO),后者可进一步反应生成HO-, NO2, NO3-等,其结果是引起和加重心肌缺血再灌注损伤［7］.
我们发现，单纯缺血1 h对心脏NOS活性无明显影响,再灌注30 min 后NOS活性即开始升高,2～6 h到达高峰,持续到6 h，此后迅速下降,24 h降低到正常以下,21 d时恢复至正常水平. RTPCR分析发现eNOS及iNOS mRNA的变化与其蛋白变化相一致. 可见在IRI中,早期eNOS的高表达可能参与了早期心血流的调节,对抑制心血管痉挛、减少炎性细胞的浸润有关；iNOS参与介导了心脏IRI的炎症损伤.可以设想,在器官保存过程中或移植后早期使用iNOS 的抑制剂,将会减少急性心肌坏死和凋亡以及急性排斥反应的发生, 对IRI 起到保护作用,促进心功能的恢复，为临床提供科学的理论依据.
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