作者：石华，成海恩，易发平，杨俊霞，张溢，马永平，宋方洲

【关键词】  白细胞介素24；克隆；真核表达；,Ca,Ski细胞

　　Molecular cloning, identification and eukaryotic expression of IL24 gene in Ca Ski cells

　　【Abstract】 AIM: To clone human IL24 (hIL24) gene and construct its eukaryotic expression vector, then transfect it into Ca Ski cells to express hIL24 protein. METHODS: hIL24 gene was acquired by RTPCR from the total RNA of Ca Ski cell and cloned into plasmid pcDNA3.1(+) to generate the eukaryotic expression vector named pcDNA3.1(+)hIL24. pcDNA3.1(+)hIL24 was transfected into Ca Ski cells to express hIL24 protein. RESULTS: PCR and sequencing revealed that hIL24 gene was successfully cloned into plasmid pcDNA3.1(+) and its eukaryotic expression vector was constructed. The vector was able to express hIL24 protein after transfected into Ca Ski cells. CONCLUSION: The hIL24 eukaryotic expression vector has been successfully constructed.

　　【Keywords】 IL24; clone; eukaryotic expression; Ca Ski cell

　　【摘要】 目的：克隆人IL24基因并构建真核表达载体，转染Ca Ski细胞进行真核表达. 方法：利用RTPCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL24基因. 将IL24基因克隆入pcDNA3.1(+)中，构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)hIL24. 将重组质粒转染入Ca Ski细胞，利用Western blot检测hIL24的表达. 结果：PCR及测序结果均证实成功克隆了人IL24基因，构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)hIL24，该质粒被转染入Ca Ski细胞中能表达出hIL24蛋白. 结论：成功构建了hIL24基因的真核表达载体.

　　【关键词】 白细胞介素24；克隆；真核表达； Ca Ski细胞

　　0引言

　　人IL24是IL10细胞因子家族中的新成员，对肿瘤细胞有特异性的抑制和杀伤作用，而对正常细胞没有影响,成为肿瘤治疗的新热点［1］.  人IL24的稳定表达有明显的组织特异性，仅限于免疫系统相关组织，如脾脏、淋巴结和外周血单个核细胞. 由于外周血单个核细胞取材方便易于操作，信捷职称论文写作发表网，目前国内一般都是从经过LPS刺激的该细胞中克隆人的IL24基因［2］. 我们从人宫颈癌Ca Ski细胞中成功克隆出人IL24基因，且与GenBank公布的序列进行比对后发现在501和648 bp两处有碱基的点突变，在国内外还未见报道. 我们利用克隆得到的hIL24基因构建真核表达载体，转染Ca Ski细胞，通过蛋白印迹实验证实该表达载体在Ca Ski细胞中能成功表达hIL24蛋白且具有免疫原性，为后续的IL24功能研究打下基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料真核表达载体pcDNA3.1(+)，E．coli菌株DH5α和人宫颈癌Ca Ski，Hela细胞均为本室保存；限制性内切酶HindIII，NotI和DNA连接试剂盒购自大连宝生物公司；Trizol,逆转录试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京鼎国公司；Taq DNA聚合酶,胶回收试剂盒购自天为时代公司；所有的抗体购自Santa cruz公司；脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；寡核苷酸引物合成由上海生工完成；核酸测序由重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室完成.

　　1.2方法人宫颈癌Ca Ski和Hela细胞分别于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃，50 mL/L CO2条件下培养. 用Trizol试剂分别抽提这两种细胞的总RNA. 根据Jiang等发表的人IL24全长cDNA序列(含信号肽)设计引物 ，上游引物为:5′ccc aag ctt acc gcc atg aat ttt caa cag agg ctg3′,在起始密码子ATG前引入Kozac序列（蓝色，能增强真核表达）和HindIII酶切位点；下游引物为：5′ata aga atg cgg ccg cct aga cat tca gag ctt gta g3′，引入NotI酶切位点. 按照常规两步法进行RTPCR. 第1步RT： 提取的总RNA取2 μL作为RT反应模板，反应体系为20 μL：随机引物(25 pmol/μL) 1 μL，dNTP(各10 mmol/L) 2 μL，逆转录酶16.67 nkat；反应参数为：30℃ 10 min, 42℃ 20 min,99℃ 5 min, 4℃ 5 min：第2步PCR：取RT反应产物5 μL作为PCR反应模板，反应体系为50 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTP(各10 mmol/L) 1 μL，Taq酶16.67 nkat；反应参数为：95℃ 5 min,1个循环；94℃ 30 s，54℃ 40 s，72℃ 40 s，30个循环；72℃ 10 min，1个循环. RTPCR产物与质粒pcDNA3.1（+）分别经HindIII和NotI双酶切并胶回收目的片段后，进行连接反应. 以常规氯化钙法转化DH5α感受态细胞，转化的菌液铺于含Amp的LB琼脂平板上过夜培养，挑取次日平板生长菌落摇菌提质粒，用PCR方法鉴定重组子，最后将初步鉴定的重组子送重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室进行序列测定. 按照Lipofectamine2000试剂盒操作规程将pcDNA3.1（+）hlL24质粒转染入传代次日融合率大约为80%的Ca Ski细胞中. 分别收集未转染质粒的Ca Ski细胞和转染真核表达质粒72h后的Ca Ski细胞的培养上清液和细胞裂解液，进行蛋白印迹分析. 实验中以actin为内参.

　　2结果

　　分别以人宫颈癌Ca Ski和Hela细胞总RNA为模板，经RTPCR，琼脂糖凝胶电泳发现只有Ca Ski细胞扩增出一条特异性条带，长度大约为650 bp，与预期大小一致. 而Hela细胞未扩增出特异性条带(图1). PCR产物与pcDNA3.1（+）质粒分别经HindIII和NotI双酶切并胶回收目的片段后，进行连接反应. 以常规氯化钙法转化DH5α感受态细胞，用PCR方法鉴定出阳性重组子,命名为pcDNA3.1（+）hlL24(图2). 最后将初步鉴定的重组子送重庆医科大学感染重点实验室进行序列测定后，与GenBank公布的编号为NM_00680的序列进行比对后发现有两处碱基的点突变，即501 bp处（G→A）伴随着氨基酸的改变（Ala→Thr）和648 bp处（T→C）伴随着氨基酸的改变（Tyr→His）. 蛋白印迹实验发现,Ca Ski细胞的培养上清和细胞裂解液中都不能检测到IL24蛋白，说明可能存在转录后调控，使IL24 mRNA不能被翻译成蛋白质. 而转染pcDNA3.1（+）hlL24真核表达质粒的Ca Ski细胞的培养上清和细胞裂解液中都能检测到IL24蛋白(图3)，说明构建的pcDNA3.1（+）hlL24真核表达质粒能在Ca Ski细胞内成功表达分泌型的IL24蛋白，且表达的蛋白具有免疫原性.

　　图1－图3　略

　　3讨论

　　IL24是一个分泌型细胞因子，可对周围癌细胞行旁观者杀灭效应［3-4］，具有刺激免疫系统的功能，还能使某些癌细胞对射线更加敏感［5］. 在多种组织起源的肿瘤细胞中，mda7/il24的抗肿瘤效应与p53, RB, p16, ras,bax和caspase3的突变状态无关，所以对P53失活的子宫颈癌细胞系特别适用. 所以我们选择含有高拷贝（约600 copy）HPV病毒的宫颈癌Ca Ski细胞作为研究IL24抑癌效应的对象. 真核表达载体是基因转导的理想载体，阳离子脂质体介导法又以其转染效率高、无免疫原性、整合和扩散性小、操作简便、容量大而受国内外学者关注，因此构建高效真核表达载体，以阳离子脂质体介导法导入合适的靶细胞，使目的基因在体内稳定表达可达到低毒、高效、安全的临床治疗目的.
　　
　　我们采用RTPCR从人宫颈癌Ca Ski细胞中克隆了hIL24基因，经测序及序列比对发现，其同GenBank数据库收录的序列基本一致，但有两处碱基的点突变，即501 bp处（G→A）伴随着氨基酸的改变（Ala→Thr）和648 bp处（T→C）伴随着氨基酸的改变（Tyr→His）. 但是发现从同为人宫颈癌细胞株的Hela细胞中却不能克隆出IL24基因. 同时，进一步研究发现，虽然从人宫颈癌Ca Ski细胞中成功克隆出人IL24基因，但是随后的蛋白印迹实验发现，Ca Ski细胞中并无IL24蛋白的表达，说明可能存在转录后调控，使IL24 mRNA不能被翻译成蛋白质. 为下一步研究IL24基因对宫颈癌Ca Ski细胞所发挥的作用及其内在机制做了前期铺垫，为宫颈癌的基因治疗研究进一步走向深入奠定了一定的实验基础.

　　【参考文献】

　　［1］ Gupta P, Su ZZ, Lebedeva IV, et al.  mda7/IL24: Multifunctional cancerspecific apoptosisinducing cytokine［J］. Pharmacol Ther, 2006,  111(3):596-628.

　　［2］ 陈雄艳, 盛伟华, 谢宇锋, 等. 人IL24基因的克隆及在COS7细胞中的表达［J］. 中华免疫学杂志，2004，20(10):672-676.

　　［3］ Su Z, Emdad L, Sauane M, et al. Unique aspects of mda7/IL24 antitumor bystander activity: Establishing a role for secretion of MDA7/IL24 protein by normal cells［J］. Oncogene, 2005, 24(51): 7552-7566.

　　［4］ Sauane M, Lebedeva IV, Su ZZ, et al. Melanoma differentiation associated gene7/interleukin24 promotes tumor cellspecific apoptosis through both secretory and nonsecretory pathways［J］. Cancer Res, 2004, 64(9):2988-2993.

　　［5］ 韩文玲, 马大龙. 新细胞因子IL24研究进展［J］. 中华免疫学杂志, 2003，19(3)：211-212.