钾离子通道在不同胎龄大鼠动脉导管收缩的作用
作者：佚名； 更新时间：2014-12-13
【摘要】 目的 研究大鼠动脉导管平滑肌中的三磷酸腺苷（ATP）敏感的钾离子通道（KATP）及电压依赖的钾通道（Kv）的发育变化及其在动脉导管收缩中的作用。方法 通过测量胎龄19天（早产）及21天（足月）（n=8）胎鼠动脉导管血管环张力及利用全细胞膜片钳技术方法测量动脉导管单个平滑肌细胞的钾离子电流，观察KATP激动剂吡拉地尔和KATP阻断剂格列本脲，Kv阻断剂4-氨基吡啶对动脉导管收缩和钾离子电流的影响。结果 格列本脲可收缩胎龄21天胎鼠的动脉导管，但对19天的无作用。钾电流可以因吡拉地尔增加，因格列本脲减少，但这种减少的电流在胎龄21天的动脉导管要明显大于19天的。4-氨基吡啶在两组作用无明显差异。结论 本研究数据提示在早产儿与足月儿比较，总的Kv电流无明显差异，但KATP电流明显减少，KATP通道未发育成熟，支持KATP在动脉导管平滑肌作为一个氧感受器，是早产儿动脉导管未闭发生率高的原因之一。
【关键词】 动脉导管；氧气；钾离子通道；早产儿
The role of potassium channels in oxygen-induced contraction of ductus arteriosus in fetal rat of different gestation age
【Abstract】 Objective To investigated the role of ATP sensitive potassium channel and voltage-dependent potassium channel in oxygen-induced contraction of ductus arterioses of rat. Methods Isometric force of contact tissue and potassium current in single smooth muscle cells of ductus arteriosus were measured in two groups of rats of 19th (premature) and 21st (mature) gestation age respectively. The effects of pinacidil(KATP activater)， glybenclamide (KATP inhibitor)， and 4-aminopyridine(KV inhibitor) were investigated.Results glybenclamide contracted ductus arteries in 21st group but not in 19th group. Potassium current increased by applying pinacidil in the perfusion solution and decreased by glybenclamide.The change of the currents， together with the depolarization of the membrane potential were significant greater in 21st group then in 19th group. No significant different effect of 4-aminopyridine was observed between two groups.Conclusion KATP but not KV channel may be one of the O2 sensors in ductus arterioses. It was underdeveloped in premature fetus. and participate in their poor reaction to oxygen and high incidence of patent ductus arteriosus.
【Key words】 ductus arteriosus； oxygen； potassium channel； premature fetus
新生儿的动脉导管通常在生后数小时到数日关闭。出生后随着呼吸的开始，血氧分压升高是动脉导管收缩的重要原因。早产儿动脉导管对氧浓度变化的反应欠佳，与早产儿动脉导管对氧的敏感性尚未成熟有关。提高灌流液氧分压可引起离体动脉导管收缩。这种氧气引发的动脉导管收缩的机制尚不明确。氧气诱导血管内皮释放内皮素是使动脉导管收缩的原因之一［1］。Roulet和Coburn［2］发现血氧分压升高可引起细胞膜去极化。研究发现ATP依赖的钾通道（ATP-dependent K channel，KATP，）阻断剂格列本脲，可收缩动脉导管；而KATP开放剂克罗卡林，可以拮抗氧气引发的动脉导管收缩［3］。因此，笔者推测富氧可以关闭KATP，从而使平滑肌细胞膜去极化。但是Tristani-Firouzi等［4］发现在动脉导管也存在着电压依赖的钾通道（voltage-dependent K channel，Kv），并在富氧的条件下关闭，因此他们认为动脉导管上的氧感受器是Kv。KATP和Kv在动脉导管收缩中的作用仍然没有定论。在我们以前的实验中发现，氧气引发的动脉导管收缩现象只在胎龄21天的胎鼠动脉导管出现，而在19天的不能引出［5］。在动脉导管中作为氧感受器的通道，在早产儿应该尚未发育成熟。因此，本研究的目的是了解胎鼠动脉导管平滑肌中KATP和Kv发育情况及它们在动脉导管收缩中的作用，以探明动脉导管的收缩机制。
1 对象与方法
1.1 对象 未生育过的Wister鼠，过夜交配后若在阴道拭子发现有精子则初步判断受孕并定为胎龄第0天（足月21.5天）。胎龄19或21天时用苯巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉母鼠后剖腹取胎鼠。整个过程遵循美国生理协会的相应规则。所有试剂及药品均来自美国Sigma公司。
1.1.1 测量张力使用完整动脉导管环 分离出胎鼠的纵隔组织并置于HEPES缓冲液中。HEPES液成分(mM)：NaCl， 142； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； HEPES， 5； 用NaOH 滴定到pH 7.4，再用100%氮气(N2)平衡。在解剖显微镜下从胸腔取出动脉导管，制备成0.4～0.6mm长的血管环段，然后放于37℃的浴槽。
1.1.2 电生理实验使用新鲜分离的单个平滑肌细胞 所有用于制备和保存单个动脉导管平滑肌细胞的液体均以100%N2平衡。动脉导管和肺动脉从胸腔取出后放置于去钙的Hanks溶液。Hanks液成分(mM)：NaCl 138.8， KCl 5.4， NaH2PO4 1.2， MgCl2 0.5， HEPES 10， EGTA 0.1， 用1M NaOH滴定到pH 7.4。然后把血管剪成小片、置于没有EGTA的Hanks’消化液，其中含有木瓜蛋白酶0.4mg/ml， 二硫苏糖醇 0.19mg/ml， 以及牛血清白蛋白0.2mg/ml；在37℃水箱中消化5～8min，再置于没有EGTA、含有胶原酶0.25mg/ml的Hanks’液，37℃消化5～7min。再把胶冻样的组织用毛细吸管移至加有10 mg/ml葡萄糖的普通Hanks’液并保存在冰中，实验开始前轻轻搅动即可获得单个细胞。
1.2 方法
1.2.1 血管张力测量 按照常用的等容收缩方法测量血管张力。用两根直径25μm的钨丝穿过血管腔，通过压力传感器(Leonia公司Kulite半导体)接到肌动描记器，并记录等容收缩的张力。实验开始后，用Krebs-Henseleit（K-H）液以10 ml/min的速度灌洗。K-H液成分（mM）： NaCl， 118； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； NaHCO3， 24； NaH2PO4， 0.436，用95%N2＋5%CO2气体平衡，使浴槽中灌洗液pH值为7.38～7.42；氧分压22～25mmHg；二氧化碳分压35～42mmHg。在使用高钾溶液(钾浓度 50 mM)时，用等摩尔的KCl替代NaCl。
记录血管轴长，两条钨丝之间的距离及牵拉开始时的牵引力。以牵引力(mN)除以血管轴长（mm）表示血管壁张力（mN/mm）。对19和21天胎龄的标本，调节其基础张力分别到0.3～0.5mN/mm (平均0.4±0.1)和 0.6～0.8mN/mm (平均0.7±0.1)。
采用3种方法使动脉导管环收缩：4μM格列本脲（KATP 通道阻断剂）；10mM 4-氨基吡啶（4-AP）（Kv阻断剂）；以及50mM KCl。格列本脲和4-AP均溶解在K-H液中。
1.2.2 膜片钳实验 低氧液以6ml/min 的速度灌洗，组织池中的氧分压由血气机（Ciba Corning 280）测定，间隔5min采样，连续3次保持在30～35mmHg时开始实验。细胞放置于操作池中，选择纺锤状、表面光滑、折光性好的平滑肌细胞。电极内液成分(mM)：KCl 20， KOH 120， MgCl2 2， EGTA 10， HEPES 5， Mg-ATP 1或5， aspartate 60 (pH 7.4)。灌流液成分(mM)：NaCl 143， KCl 5.4， NaH2PO4 0.33， MgCl2 0.5， HEPES 5， NaOH调节pH到7.4。灌流液用100%氮气平衡。利用二甲亚砜溶解KATP激动剂吡拉地尔和KATP 通道阻断剂格列本脲，并使后二者在灌流液中的浓度分别为1～10μM和4μM。灌流液中二甲亚砜的浓度不超过0.2%。
电极后尖端阻抗为5～6MΩ。调整微推进器，完成GΩ封闭后，副压吸引形成全细胞结构。利用Axopatch 200B 放大器，由 pClamp8.2 发放刺激脉冲，采样频率为10kHz，低通滤波频率为2kHz，
【关键词】 动脉导管；氧气；钾离子通道；早产儿
The role of potassium channels in oxygen-induced contraction of ductus arteriosus in fetal rat of different gestation age
【Abstract】 Objective To investigated the role of ATP sensitive potassium channel and voltage-dependent potassium channel in oxygen-induced contraction of ductus arterioses of rat. Methods Isometric force of contact tissue and potassium current in single smooth muscle cells of ductus arteriosus were measured in two groups of rats of 19th (premature) and 21st (mature) gestation age respectively. The effects of pinacidil(KATP activater)， glybenclamide (KATP inhibitor)， and 4-aminopyridine(KV inhibitor) were investigated.Results glybenclamide contracted ductus arteries in 21st group but not in 19th group. Potassium current increased by applying pinacidil in the perfusion solution and decreased by glybenclamide.The change of the currents， together with the depolarization of the membrane potential were significant greater in 21st group then in 19th group. No significant different effect of 4-aminopyridine was observed between two groups.Conclusion KATP but not KV channel may be one of the O2 sensors in ductus arterioses. It was underdeveloped in premature fetus. and participate in their poor reaction to oxygen and high incidence of patent ductus arteriosus.
【Key words】 ductus arteriosus； oxygen； potassium channel； premature fetus
新生儿的动脉导管通常在生后数小时到数日关闭。出生后随着呼吸的开始，血氧分压升高是动脉导管收缩的重要原因。早产儿动脉导管对氧浓度变化的反应欠佳，与早产儿动脉导管对氧的敏感性尚未成熟有关。提高灌流液氧分压可引起离体动脉导管收缩。这种氧气引发的动脉导管收缩的机制尚不明确。氧气诱导血管内皮释放内皮素是使动脉导管收缩的原因之一［1］。Roulet和Coburn［2］发现血氧分压升高可引起细胞膜去极化。研究发现ATP依赖的钾通道（ATP-dependent K channel，KATP，）阻断剂格列本脲，可收缩动脉导管；而KATP开放剂克罗卡林，可以拮抗氧气引发的动脉导管收缩［3］。因此，笔者推测富氧可以关闭KATP，从而使平滑肌细胞膜去极化。但是Tristani-Firouzi等［4］发现在动脉导管也存在着电压依赖的钾通道（voltage-dependent K channel，Kv），并在富氧的条件下关闭，因此他们认为动脉导管上的氧感受器是Kv。KATP和Kv在动脉导管收缩中的作用仍然没有定论。在我们以前的实验中发现，氧气引发的动脉导管收缩现象只在胎龄21天的胎鼠动脉导管出现，而在19天的不能引出［5］。在动脉导管中作为氧感受器的通道，在早产儿应该尚未发育成熟。因此，本研究的目的是了解胎鼠动脉导管平滑肌中KATP和Kv发育情况及它们在动脉导管收缩中的作用，以探明动脉导管的收缩机制。
1 对象与方法
1.1 对象 未生育过的Wister鼠，过夜交配后若在阴道拭子发现有精子则初步判断受孕并定为胎龄第0天（足月21.5天）。胎龄19或21天时用苯巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉母鼠后剖腹取胎鼠。整个过程遵循美国生理协会的相应规则。所有试剂及药品均来自美国Sigma公司。
1.1.1 测量张力使用完整动脉导管环 分离出胎鼠的纵隔组织并置于HEPES缓冲液中。HEPES液成分(mM)：NaCl， 142； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； HEPES， 5； 用NaOH 滴定到pH 7.4，再用100%氮气(N2)平衡。在解剖显微镜下从胸腔取出动脉导管，制备成0.4～0.6mm长的血管环段，然后放于37℃的浴槽。
1.1.2 电生理实验使用新鲜分离的单个平滑肌细胞 所有用于制备和保存单个动脉导管平滑肌细胞的液体均以100%N2平衡。动脉导管和肺动脉从胸腔取出后放置于去钙的Hanks溶液。Hanks液成分(mM)：NaCl 138.8， KCl 5.4， NaH2PO4 1.2， MgCl2 0.5， HEPES 10， EGTA 0.1， 用1M NaOH滴定到pH 7.4。然后把血管剪成小片、置于没有EGTA的Hanks’消化液，其中含有木瓜蛋白酶0.4mg/ml， 二硫苏糖醇 0.19mg/ml， 以及牛血清白蛋白0.2mg/ml；在37℃水箱中消化5～8min，再置于没有EGTA、含有胶原酶0.25mg/ml的Hanks’液，37℃消化5～7min。再把胶冻样的组织用毛细吸管移至加有10 mg/ml葡萄糖的普通Hanks’液并保存在冰中，实验开始前轻轻搅动即可获得单个细胞。
1.2 方法
1.2.1 血管张力测量 按照常用的等容收缩方法测量血管张力。用两根直径25μm的钨丝穿过血管腔，通过压力传感器(Leonia公司Kulite半导体)接到肌动描记器，并记录等容收缩的张力。实验开始后，用Krebs-Henseleit（K-H）液以10 ml/min的速度灌洗。K-H液成分（mM）： NaCl， 118； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； NaHCO3， 24； NaH2PO4， 0.436，用95%N2＋5%CO2气体平衡，使浴槽中灌洗液pH值为7.38～7.42；氧分压22～25mmHg；二氧化碳分压35～42mmHg。在使用高钾溶液(钾浓度 50 mM)时，用等摩尔的KCl替代NaCl。
记录血管轴长，两条钨丝之间的距离及牵拉开始时的牵引力。以牵引力(mN)除以血管轴长（mm）表示血管壁张力（mN/mm）。对19和21天胎龄的标本，调节其基础张力分别到0.3～0.5mN/mm (平均0.4±0.1)和 0.6～0.8mN/mm (平均0.7±0.1)。
采用3种方法使动脉导管环收缩：4μM格列本脲（KATP 通道阻断剂）；10mM 4-氨基吡啶（4-AP）（Kv阻断剂）；以及50mM KCl。格列本脲和4-AP均溶解在K-H液中。
1.2.2 膜片钳实验 低氧液以6ml/min 的速度灌洗，组织池中的氧分压由血气机（Ciba Corning 280）测定，间隔5min采样，连续3次保持在30～35mmHg时开始实验。细胞放置于操作池中，选择纺锤状、表面光滑、折光性好的平滑肌细胞。电极内液成分(mM)：KCl 20， KOH 120， MgCl2 2， EGTA 10， HEPES 5， Mg-ATP 1或5， aspartate 60 (pH 7.4)。灌流液成分(mM)：NaCl 143， KCl 5.4， NaH2PO4 0.33， MgCl2 0.5， HEPES 5， NaOH调节pH到7.4。灌流液用100%氮气平衡。利用二甲亚砜溶解KATP激动剂吡拉地尔和KATP 通道阻断剂格列本脲，并使后二者在灌流液中的浓度分别为1～10μM和4μM。灌流液中二甲亚砜的浓度不超过0.2%。
电极后尖端阻抗为5～6MΩ。调整微推进器，完成GΩ封闭后，副压吸引形成全细胞结构。利用Axopatch 200B 放大器，由 pClamp8.2 发放刺激脉冲，采样频率为10kHz，低通滤波频率为2kHz，
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