1.3 统计学方法 在Stateview及Clamfit分析软件下处理结果。取电流时程的最后400ms数据进行测量。结果用平均值±标准差表示。未配对的两组均值比较采用t检验。对药物反应的统计学比较采用配对t-检验和分析变量的重复测定。P<0.05提示有统计学意义。
2 结果
2.1 动脉导管张力 高钾(50mM)使细胞膜去极化，在两组(n=8).均可使动脉导管收缩（P>0.05）；在两组均可观察到4-AP引起的血管收缩（P>0.05）；只在21天组可见由格列本脲引起的动脉导管收缩(P<0.05)。
2.2 动脉导管平滑肌细胞钾电流 在生理条件下不同血管平滑肌细胞内的ATP浓度约为1.5～4mM［6，7］。但是在低氧环境下动脉导管平滑肌细胞内的ATP浓度未见报道。 本实验中选择1mM和5mM二种浓度作为电极液来测量KATP 电流。当使用ATP浓度为5 mM的电极液时，两组均显示被格列本脲阻断的钾离子电流最小，提示在这时KATP 通道是关闭的。同时，笔者还观察了吡拉地尔和格列本脲的作用。即使在5 mM ATP 内液的情况下，吡拉地尔仍然可以有效地激活钾离子通道。因为在高浓度时(>100μM)吡拉地尔也会激活KCa通道［8］，故在用吡拉地尔之前常规加入1 mMTEAC 以减少误差。
在21天组，由10 μM 吡拉地尔激活的钾电流比19天组明显增多。在两组中均发现10 μM 吡拉地尔激活的钾电流最大，浓度继续升高并没有同期增多的电流。被格列本脲阻断的钾电流大小与被10 μM 吡拉地尔激活的钾电流大小相等。这种电流在21天组明显大于19天组。
当使用1 μM ATP 作为电极液时，4 μM 格列本脲可明显抑制钾电流， 提示在这种条件下KATP 是开放的。而且这种电流在21天组明显大于19天组（P <0.05）。吡拉地尔可激活钾通道，而且这些被激活的电流可以被格列本脲阻断，阻断的电流比激活的稍大，也表明在基础条件下，有部分KATP 是开放的。这种被阻断的钾离子电流在足月组也明显高于早产组。
两组的膜电位没有差别(足月组-40.7±3.3 mV，早产组-41.5±4.0 mV)。格列本脲可明显改变单个细胞膜电位，并且在两组间有明显差异(足月组33.3±3.3 mV，早产组8.2±2.8 mV，P<0.01)。
3 讨论
细胞内ATP浓度低时KATP 通道开放［9］，这时给予格列本脲可以使之关闭。如果有较多的KATP 通道被关闭，可以导致细胞膜的去极化，从而开放电压依赖的钙通道，增加细胞内钙浓度，使血管平滑肌收缩。有报道格列本脲可以收缩足月新生兔的动脉导管［3］。本实验中，格列本脲也可使足月大鼠的动脉导管发生明显收缩。这些数据提示在低氧环境，成熟胎鼠动脉导管KATP是开放并且有功能的。但在未成熟胎鼠却看不到这种格列本脲引起的动脉导管收缩现象，提示在未成熟胎儿动脉导管的KATP 是无功能或者是未发育完善的。在我们以前的实验中证实了氧气可以使胎龄21天的大鼠动脉导管收缩但对19天的无效；而且未成熟胎儿的血管收缩系统，包括平滑肌细胞膜的去极化、细胞内钙浓度的增加以及细胞内钙活化收缩蛋白等与成熟胎儿比较没有明显差别，但对血氧变化的感应机制不成熟［5］。这些结果支持KATP 是动脉导管的氧感受器之一。因为4-AP引起的收缩在两组无明显差别，提示在早产鼠动脉导管的总的Kv通道与成熟鼠没有区别。当然，因为Kv通道有很多亚类， 在未成熟胎儿的动脉导管也可能存在某些KV亚类发育不完善，尚不能完全排除KV 也是动脉导管的氧感受器之一。
KATP 通道的活性与细胞内三磷酸腺苷（ATP）， 二磷酸腺苷(ADP)和其他二磷酸核苷的浓度及比例有关［10］。在缺氧时血管平滑肌组织ATP浓度是否降低仍无定论。以前的实验显示，在动脉导管组织，当灌流液从低氧改到富氧状态后，由340nm 激发的自发荧光强度虽然降低得不多但具有统计学意义［3］。提示荧光底物（如吡啶核苷酸）浓度在低氧环境中因为无氧代谢而有所增加。Shigemori［11］提出低氧环境可以明显降低门静脉和肺动脉中的ATP浓度；但Leach等［6］在报告中指出， 在静息状态且没有受到牵拉的动脉，低氧并不会明显降低其组织ATP浓度。在生理状态下，血管平滑肌细胞内的ATP浓度为1.5 ～4mM［6，7］。在本研究中，笔者选择了两种ATP浓度作为吸液管内液：1mM和5mM。在吸液管内液ATP浓度为1mM时，格列本脲可以明显阻断钾电流，而在5mM组则未见此现象。这表明 KATP 通道在1 mM ATP这表明KATP 通道在1 mM ATP环境中是开放的，而在5 mM ATP 环境中是被抑制的。有报道当ATP浓度在10～200μM时，血管平滑肌细胞的KATP 电流可以有一半被阻断［10］。本研究也发现在动脉导管平滑肌细胞，较高浓度ATP可以阻断其KATP 电流。在缺氧状态时的ATP浓度改变，可以改变KATP通道的活性，从而使动脉导管扩张。但是不同部位血管组织的KATP 通道对ATP的敏感性可能是不同的［10］。
本研究中，被吡拉地尔激活、格列本脲阻断的钾离子电流在足月组明显大于早产组。表明在早产组动脉导管平滑肌细胞膜上的KATP 通道尚未发育成熟。有人可能会认为在早产组KATP 通道也是存在的，只是被1 mM的ATP所抑制了；但实际上吡拉地尔在3 mM ATP 的条件下仍然可以激活KATP 电流［10，12，13］。
胎鼠动脉导管平滑肌细胞膜电位与文献报道值近似［2］。与张力实验结果一致，由格列本脲引起的膜电位的降低在足月组明显大于早产组。有报道在完整动脉导管，去极化到15 mV可以引起最大收缩的25%的收缩，去极化到21 mV则引起完全收缩。虽然格列本脲对单个细胞膜电位的影响与整体组织的可能有差异，我们的研究也提示了格列本脲引起的去极化在早产组没有足月组明显。
总之，本研究结果表明：在未成熟胎儿的动脉导管平滑肌细胞膜上的ATP依赖的钾离子通道是未发育完善的。本研究结果支持ATP依赖的钾离子通道是动脉导管平滑肌细胞膜上的血氧感受器之一的假设。也支持在早产儿KATP的发育不成熟是在其动脉导管观察不到氧诱发的收缩现象的原因之一的假设。
【参考文献】
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