【关键词】 二十碳五烯酸；HepG2细胞；细胞凋亡；线粒体
Effects of eicosapentaenoic acid on apoptosis and mitochondria in HepG2 cells
【Abstract】 AIM: To investigate the mitochondria changes in human hepatoblastoma G2 （HepG2） cell apoptosis induced by eicosapentaenoic acid (EPA). METHODS: In the HepG2 cells incubated with EPA in vitro， cell apoptosis was detected by DNA Ladder, the changes of mitochondria function and quantity were determined with methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） colorimetric assay and fluorescence probe. The expression and activity of Caspase9 were measured in HepG2 cell apoptosis with Western blotting and special substrate. RESULTS: Twentyfour hours after exposure to 120 μmol/L EPA， HepG2 cells displayed the apoptosis by the DNA ladder pattern; the number of the mitochondria was decreased; the A value by the MTT test was 0.173±0.065, which indicated that the function of mitochondria was significantly declined (P<0.01); compared with the untreated HepG2 cells, the expression of Caspase9 was upregulated and the activity of Caspase9 was increased to 75.4±4.8 in HepG2 cells treated with EPA (P<0.01). CONCLUSION: The changes of mitochondria may play a great role in the HepG2 cell apoptosis induced by EPA.
【Keywords】 eicosapentaenoic acid; HepG2 cells; apoptosis; mitochondria
【摘要】 目的：探讨二十碳五烯酸（EPA）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对线粒体的影响. 方法：HepG2细胞与经EPA处理后，DNA Ladder检测细胞凋亡的发生，应用线粒体荧光探针和四唑盐（MTT）比色法分析细胞线粒体数量和功能，应用免疫印迹法和特异性底物检测HepG2细胞Caspase9蛋白酶的表达和活性. 结果：终浓度为120 μmol/L EPA处理HepG2细胞24 h后，可以检测到凋亡标志性的DNA梯形带；细胞线粒体数量减少，MTT比色法检测A值为0.173±0.065（P<0.01），提示线粒体功能降低；线粒体相关凋亡级联反应的启动分子Caspase9蛋白表达增加，Caspase9酶活性增强至75.4±4.8，与未经EPA处理HepG2细胞相比差异有统计学意义（P<0.01）. 结论：EPA可能通过损伤线粒体诱导人肝癌HepG2细胞凋亡.
【关键词】 二十碳五烯酸；HepG2细胞；细胞凋亡；线粒体
二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）属于n3多不饱和脂肪酸（n3 polyunsaturated fatty acid，n3PUFA），主要存在于深海鱼油中，是一类对人体有益的重要营养素. 近来的研究表明n3PUFA可以抑制肿瘤细胞增殖，具有一定的抗瘤功效［1］，其中诱导肿瘤细胞凋亡可能是主要机制之一［2］. 有研究发现，EPA可以通过p53依赖，Fas介导途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡［3］. 我们采用DNA梯形带检测, MTT比色法和激光扫描共聚焦显微镜检测等方法，通过观察EPA对体外培养的HepG2细胞凋亡和线粒体的影响，初步探讨线粒体损伤在EPA诱导HepG2细胞凋亡过程中所发挥的作用，为进一步研究n3PUFA在抗肿瘤方面的功效提供一定的理论基础.
1材料和方法
1.1材料人肝癌HepG2细胞购自中国科学院上海生化与细胞所；DMEM培养基购自美国Gibco公司；EPA，信捷职称论文写作发表网，四唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；线粒体荧光探针MitoTracker Red购自美国Molecular Probe公司；小鼠抗人Caspase9 mAb为美国NeoMarker公司产品；Caspase9蛋白酶特异性底物AcLEHDAMC 为美国Alexis公司产品.
1.2方法
1.2.1细胞培养与分组HepG2细胞常规培养于含有10 mL/L小牛血清的DMEM培养液. 试验分为：处理组HepG2细胞于对数生长期应用EPA（终浓度为120 μmol/L培养液）处理24 h后收获；对照组采用正常培养未经EPA处理的HepG2细胞.
1.2.2DNA梯形带法检测细胞凋亡细胞经处理后收获约1×106个细胞，PBS洗涤细胞2次，加150 μL NP40裂解液裂解细胞5 h，离心收集上清，150 μL NP40细胞裂解液重复抽提沉淀1次，将上清置于等体积10 g/L SDS溶液中并混匀，加入RNase A（终浓度为2 μg/mL），56℃孵育2 h，加蛋白酶K至终浓度为2 μg/mL，37℃水浴2 h，加1/2体积的10 mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃过夜，4℃高速离心30 s，弃上清，750 mL/L冰冷乙醇漂洗沉淀，20 μL TE缓冲液溶解DNA，取5 μL DNA进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳.
1.2.3激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体HepG2细胞制成细胞爬片，处理组细胞经终浓度为120 μmol/L的EPA处理24 h后收获. 两组细胞用无血清培养液冲洗1次，加入线粒体探针MitoTracker Red（无血清培养基1∶5000稀释） 37℃孵育40 min，无血清培养液冲洗3次，应用激光共聚焦显微镜，绿色激发光激发下观察并照相.
1.2.4MTT比色法检测线粒体功能［4］HepG2细胞传代后培养于6孔板中，每孔5.0×106个细胞，每组设3个复孔. 两组细胞用不含血清的培养液清洗，每孔加入100 μL MTT（5 g/L浓度溶解于PBS中），37℃孵育1 h，弃上清液，每孔加入3 mL细胞裂解液， 570 nm处测量A值. 两组以相同方法重复检测3次.
1.2.5免疫印迹法检测Caspase9蛋白表达收获处理组和对照组细胞约1×107个，加入100 μL冰预冷的NP40细胞裂解液（50 mmol/L, pH 8.0 Tris・Cl, 150 mmol/L NaCl，25 mmol/L NaF，5 mmol/L Na4P2O7-，1 g/L SDS，1 mmol/L PMSF，10 μg/mL Aprotinin，10 μg/mL Leupeptin，10 g/L NP40）冰上静置裂解30 min，4℃, 12 000 g离心15 min，收集上清，Brodford法测定蛋白含量. 取20 μg蛋白，用细胞裂解液稀释至20 μL，加20 μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5～10 min，100 g/L SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜，10 g/L BSA室温封闭1 h，然后加入小鼠抗人Caspase9 mAb（1∶100稀释）37℃孵育1 h，使用羊抗鼠SP试剂盒反应，DAB显色.
1.2.6Caspase9活性检测［5］两组均收获约1×106个细胞，PBS洗涤2次，离心弃上清，加入500 μL细胞裂解缓冲液（10 mmol/L, pH7.5 Tris，30 mmol/L NaCl，10 mmol/L NaF，10 mmol/L NaPi，10 mol/L NaPPi，10 mL/L Trion X100）轻柔重悬细胞沉淀后立即放入液氮中速冻，然后置于-80℃冻存备用. 进行活性分析时，细胞沉淀悬液融化后轻微混匀，18 000 g，4℃离心12 min，取上清以Brodford法进行蛋白定量（读取A595 nm值）. 取100 μL蛋白提取液，加入1.9 mL反应缓冲液（20 mmol/L, pH 7.4 HepesKOH，100 mL/L甘油，20 mmol/L DTT， 20 μmol/L AcLEHDAMC），混匀，37℃避光孵育30～60 min，用荧光分光光度计在狭缝2，激发光380 nm，发射光460 nm条件下测量A460 nm值. 两组以相同方法重复检测3次. 酶活性以A460 nm／A595 nm表示.
统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1EPA诱导HepG2细胞凋亡的检测DNA梯形带检测结果显示HepG2细胞染色质DNA裂解成180～200 bp和不同倍数的片段，在琼脂糖凝胶电泳显示出凋亡细胞特有梯形带（图1）.
2.2EPA对HepG2细胞线粒体数量的影响线粒体荧光探针可以特异性标记细胞线粒体，在绿色激发光激发下发出红色荧光. 激光共聚焦显微镜下可见未经EPA处理的HepG2细胞生长状态良好，红色荧光明亮，均匀分布于胞质区. 经120 μmol/L EPA处理 24 h后，HepG2细胞生长稀疏，形态趋于圆形，荧光强度明显减弱，提示细胞线粒体数量明显减少（图2）.
2.3EPA对HepG2细胞线粒体功能的影响研究结果显示，未经EPA处
