2.4EPA对HepG2细胞Caspase9蛋白酶表达和活性的影响免疫印迹检测结果显示Caspase9蛋白表达增加. 以特异性荧光底物分析Caspase9蛋白酶活性，结果表明，未经EPA处理的HepG2细胞Caspase9活性为32.7±3.6， 经EPA处理24 h后细胞Caspase9活性达到75.4±4.8，差异具有统计学意义（P<0.01，图3）.

    3讨论

    作为一种人体需要的重要营养素，n3PUFA的抗瘤功能逐渐受到关注. 研究发现n3PUFA可以诱导肿瘤细胞凋亡［6］，而我们使用EPA处理肝癌HepG2细胞后可以检测到凋亡标志性的DNA梯形带，说明EPA也可以在体外诱导肝癌HepG2细胞凋亡的发生.

    线粒体是参与细胞凋亡的关键因素，目前的观点认为线粒体既是细胞凋亡的启动者，又是凋亡信号的放大者. 凋亡过程中一个重要的特征就是线粒体膜功能的改变即线粒体的通透性改变，这是调节凋亡的中心环节. 凋亡诱导因素可以诱导MPT开放，导致线粒体跨膜电位(△ψm)下降或消失，随后呼吸链脱耦联，造成线粒体自身损伤，产生活性氧类及向胞质释放多种蛋白酶活化物，包括凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor, AIF）,细胞色素C(Cyt C)和凋亡蛋白酶激活因子1（apoptosis protease activating factor1, Apaf1）等. AIF可以直接进入细胞核，导致染色体浓缩、断裂［7］. 而Caspase9蛋白酶是线粒体依赖Caspase级联反应的启动分子，与线粒体释放的Cyt C和Apaf1结合形成凋亡复合体后被激活，活化的Caspase9可以进一步裂解活化下游Caspase蛋白酶，启动Caspase级联反应，进一步诱导细胞凋亡的发生. 国外曾报道在n3脂肪酸诱导人白血病HL60细胞凋亡过程中，线粒体去极化和上调半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的表达和/或活性可能与此过程密切相关［8］.

    我们的试验结果表明，HepG2细胞经EPA处理后，细胞生长减缓，死亡细胞增多，同时可以观察到细胞线粒体数目明显减少，应用MTT比色法检测细胞线粒体功能，发现在EPA作用下HepG2细胞线粒体功能显著降低. 对细胞Caspase9蛋白酶的检测结果表明，在EPA作用下HepG2细胞Caspase9蛋白酶表达增加，活性增强. 由此我们认为在诱导HepG2细胞凋亡的过程中，EPA对细胞线粒体结构和功能的影响可能发挥了重要作用，其中线粒体依赖的Caspase级联反应可能是凋亡事件的重要组成部分. 此外，有报道EPA可以通过促进线粒体生成过氧化物，释放AIF1，通过不依赖Caspase的途径诱导鼠白血病RBL2H3细胞凋亡［9］，但在EPA诱导HepG2细胞凋亡过程中是否存在相同机制还有待进一步研究.

    【参考文献】

    ［1］ Schley PD, Jijon HB, Robinson LE, et al. Mechanisms of omega3 fatty acidinduced growth inhibition in MDAMB231 human breast cancer cells ［J］. Breast Cancer Res Treat, 2005, 92(2):187-195.

    ［2］   Heimli H, Hollung K, Drevon CA. Eicosapentaenoic acidinduced apoptosis depends on acyl CoAsynthetase［J］. Lipids, 2003, 38(3):263-268.

    ［3］   Chi TY, Chen GG, Lai PB. Eicosapentaenoic acid induces Fasmediated apoptosis through a p53dependent pathway in hepatoma cells［J］. Cancer J, 2004, 10(3):190-200.

    ［4］   Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Reexamination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill ［J］. J Immunol Methods, 1989, 119(2):203-210.

    ［5］   Reiners JJ Jr, Clift RE. Aryl hydrocarbon receptor regulation of ceramideinduced apoptosis in murine hepatoma 1c1c7 cells. A function independent of aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator［J］. J Biol Chem, 1999, 274(4): 2502-2510.

    ［6］   Shirota T, Haji S, Yamasaki M, et al. Apoptosis in human pancreatic cancer cells induced by eicosapentaenoic acid［J］. Nutrition, 2005, 21(10):1010-1017.

    ［7］   于翠娟,孟艳玲,王成济,等. 凋亡诱导因子是线粒体内介导核凋亡的最主要蛋白质之一［J］.第四军医大学学报，2002, 23(17): 1599.

    ［8］   Arita K, Kobuchi H, Utsumi T. Mechanism of apoptosis in HL60 cells induced by n3 and n6 polyunsaturated fatty acids［J］. BiochemPharmacol, 2001, 62(7): 821-828.

    ［9］  Koumura T, Nakamura C, Nakagawa Y. Involvement of hydroperoxide in mitochondria in the induction of apoptosis by the eicosapentaenoic acid［J］. Free Radic Res, 2005, 39(3):225-235.