作者：丁守怡，钱冬萌，牟文凤，闫志勇，宋旭霞，王斌

【关键词】  表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱；蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞,培养的；差异蛋白

　　Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using  SELDI

　　【Abstract】  AIM:  To examine the differential expressions of  proteins in hepatoma cell line (HepG2),hepatoma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS), so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at the protein level. METHODS:  The 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption, SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of  proteomes of HepG2, HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were  captured by WCX2 array. Compared with normal liver cell lines, in the segments from Mr 5000 to 15 000, proteins in the HepG2 and HepG2.2.15  showed apparent changes, in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells, the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10 proteins in HepG 2.2.15 were increased. CONCLUSION: The   SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience, high sensitivity, and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific proteins we found  have a  potential applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepatoma at the level of proteins, as well as the searching of new therapeutic target sites.

　　【Keywords】  SELDITOFMS;   protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells, cultured;   distinct protein

　　【摘要】 目的： 运用表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱(SELDITOFMS) 技术,检测体外培养的肝癌细胞株（HepG2）,转染乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）与正常肝细胞株（LO2）蛋白质的差异表达，筛选肝细胞癌的标志蛋白，为进一步研究肝癌发病的蛋白质组学机制奠定基础. 方法： 常规培养上述3种细胞，细胞状态良好时收集细胞，裂解细胞后采用 SELDITOFMS技术用WCX2芯片检测HepG2, HepG2.2.15, LO2细胞内蛋白质组学的差异表达. 结果：  WCX2芯片共捕获91个蛋白，在Mr 5000~15 000区段，与正常肝细胞株比较，有7个蛋白质在两种肝癌细胞中出现明显变化，其中2个蛋白在肝癌细胞中表达量增高，5个蛋白在肝癌细胞中表达量降低；另外两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白，9个蛋白分子在HepG2表达量增高，10个蛋白分子在HepG2.2.15表达量增高. 结论： SELDI蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方法，它简便，敏感性高，重复性好，本文发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，信捷职称论文写作发表网，对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义，从而为从蛋白质水平研究肝癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础.
 
　　【关键词】 表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱；蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞，培养的；差异蛋白

　　0引言

　　原发性肝癌(HCC)在我国是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在部分城市中占恶性肿瘤死因的第二位. 每年有11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%. 肝癌早期没有明显体征，多数病人确诊时已属晚期，难以治愈，死亡率很高. 所以，对于肝癌的早期诊断，在无症状的人群中发现早期病例，对控制肝癌的病死率有现实的意义. 因此，研究并寻找有价值的预警肝癌的标志物，成为进一步提高肝癌临床治疗水平的关键. 任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，癌症的发生是一个多基因多阶段多因子的动力学过程，HCC也不例外，目前对肝癌发生机制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表达的蛋白质水平，因此，要求对生物功能的执行者蛋白质进行研究.
 
　　蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质［1］. 蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质组概念的延伸，是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的学科. 蛋白质组学技术为研究肿瘤标志物与肿瘤进展转移研究提供良好的技术平台, 为研究开辟了新的手段和视角. SELDI蛋白质芯片技术是近年来新兴的一种蛋白质组学技术，它具有简单、快捷、灵敏等特点，可以检测分子量在Mr 500~500 000之间的蛋白或多肽，而且所需样本体积小（0.5~400 μL）［2-3］. 我们应用细胞裂解液裂解体外培养的3种细胞（LO2, HepG2, HepG2.2.15），进行了表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱技术（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝细胞、肝癌细胞与转染乙肝病毒的肝癌细胞的蛋白表达图谱［4］，发现了一系列（信噪比）差异表达的蛋白，为今后从血清或肝癌组织中筛选标志蛋白提供科学依据.

　　1材料与方法

　　1.1材料正常肝细胞株（LO2）购自中科院上海细胞库；肝癌细胞株（HepG2）及携带乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）由第四军医大学吴力克主任医师赠送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA）,TritonX100，尿素，4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性剂（CHAPS）均购自美国Sigma公司，蛋白质芯片时间质谱分析仪（PBSⅡC）及WCX2（弱阳离子交换芯片）购自美国Ciphergen Biosystems公司.
 
　　1.2方法

　　1.2.1细胞总蛋白质的提取LO2,  HepG2细胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培养基培养，HepG2.2.15细胞另外加入终浓度200 g/L的G418,细胞长成单层后，用无菌细胞刮刀刮取细胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea, 40 g/L CHAPS,  40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 μL, 4℃剧烈震荡30 min, 20 817 g离心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系统测定蛋白浓度，用裂解液调节至所有样品浓度为2 g/L，其余上清分装-86℃备用. 每种细胞收获3次，以排除组间差别. 每份样品至少在2个以上的同种芯片上检测，以排除不同芯片间的差异.
 
　　1.2.2WCX2蛋白芯片操作步骤将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入200 μL结合/洗脱缓冲液（50 mmol/L NaAc, pH 4.0）预处理芯片，室温下200 r/min振荡5 min，弃缓冲液，重复上述操作1次. 每孔加入50 μL 1∶2稀释的样品，剧烈震荡，室温孵育1 h. 弃掉样品，每孔用200 μL结合/洗涤缓冲液洗涤2次，每次震荡5 min. 弃去孔中液体，每孔加入200 μL HPLC 水，立刻甩出. 从蛋白工作平台中取出芯片，空气中干燥，每孔加入0.5 μL EAM（SPA中加入75 μL乙氰和75 μL 10 mL/L三氟乙酸）重复1次. 干燥后用蛋白质芯片阅读机进行质谱分析.
  
　　1.2.3数据采集和结果分析用加有Allinone标准分子量蛋白的NP20芯片校正质谱仪