2结果
2.1重复性试验为了保证试验结果的可靠性，我们首先进行细胞计数为1010/L，样品蛋白浓度为2 g/L以减少细胞本身蛋白的差异；同时每种细胞收获3次，以排除组间差别；每份样品至少在同种芯片3个以上不同点进行检测，以排除不同芯片点之间的差异. 然后用SELDITOFMS对样品孔进行测定，经质谱分析后选择了8个蛋白峰，测变异系数，结果显示其M/Z及强度的CV分别为1%, 5%，分析结果表明试验重复性好，结果可靠.
2.2差异蛋白的比较
2.2.1LO2, HepG2, HepG2.2.15三者比较明显差异蛋白峰共7个，其中Mr 7945, 7979在肝癌细胞中表达增高， 5818, 8428, 10 106, 10 312, 11 084在肝癌细胞中表达降低（图1）.
2.2.2肝癌细胞和转染乙肝病毒的肝癌细胞蛋白质表达差异HepG2, HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个， 9个蛋白峰在肝癌细胞中表达增高，10个蛋白峰在肝癌细胞中表达降低（图2）.
2.2.3差异蛋白质的初步鉴定将发现的差异蛋白峰在Swiss蛋白数据库中搜索（），发现Mr 11 084.0蛋白峰与钙结合蛋白S100 A10相符. 其他几种蛋白暂时寻找不到.
A： LO2细胞；B： HepG2.2.15细胞；C： HepG2细胞. 上部分为蛋白峰表达情况: 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度；Mr 11 084.6, 10 106.4蛋白在LO2中表达最高，在HepG2中次之，在HepG2.2.15中最低. 下部分为蛋白质图谱的模拟凝胶图： Mr 11 084.6, 10 106.4两条带是LO2, HepG2.2.15和HepG2细胞的差异蛋白.
图13种细胞在Mr 10 000~11 500区段的蛋白质检测结果（略）
A: Chip 19C G2; B: Chip 19H 2.2.15. 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度. Mr 10 106.4, 11 084.0, 11 658.4蛋白在HepG2中高表达，在HepG2.2.15中低表达.
图2HepG2, HepG2.2.15细胞在Mr 10 000~12 000区段的蛋白质检测结果（略）
3讨论
肿瘤早期就可在蛋白质水平出现细微但重要的组合改变［5］，近来研究表明,肿瘤性疾病从蛋白质组学的角度又可以被认为是一种蛋白质缺陷病,其发生过程中有多种蛋白会发生异常变化. 从组织增生产生原位癌到产生癌变的过程中,有不同的功能性蛋白的参与；转移也是多步骤复杂连续的过程, 与转移有关的特殊基因受到激活并有多种水解酶的参与. 总之, 肿瘤在发生发展转移的过程中, 在分子水平有不同的功能性蛋白参与, 并且功能性蛋白很可能在各个环节相互协调共同表达. 蛋白表达异常不仅包括蛋白表达量的增加或减少,还包括蛋白翻译后加工上的改变,从而导致肿瘤组织表达的蛋白质谱(protein profile) 的改变. 因此利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地诊断肿瘤及了解肿瘤的发病机制.
临床上现有的HCC标志物众多，但尚无单一标志物能够诊断所有HCC. 这就需要探索一种新的技术以发现早期肿瘤标志物. SELDI蛋白质芯片技术可检测疾病进展中不同阶段血清中多肽量的变化，翻译后修饰的改变或某些多肽的聚糖结构变化，为HCC肿瘤标志物的进展提供了一个新的方法，它灵敏度高、特异性好、重复性强、操作简单且微量化［6］，可同时检测血清中的多种蛋白质已被应用于检测多种生物学样品.
体外培养的细胞株虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一、均质性好、实验条件容易控制等优点. 尤其在做对比性研究时可避免由组织细胞成分复杂，细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠［7］. 我们培养了LO2, HepG2和HepG2.2.15细胞，裂解细胞蛋白定量后SELDITOFMS分析蛋白表达的差异. WCX2芯片，用于分析正电荷蛋白，弱阳离子碳化合物构成活性位点，与样品中赖、精或组氨酸反应，它捕获的蛋白pI一般大于4. 我们在分子量Mr 3000~30 000范围内，共捕获91个蛋白峰. 其中肝癌细胞株与正常肝细胞株差异蛋白共7个，不同亚型肝癌细胞与正常肝细胞比较有共同的差异蛋白，说明在肝癌的发生或发展过程中涉及到一些共同的蛋白质改变；我们对不同类型的肝癌细胞株差异蛋白质进行分析，结果HepG2, HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个，表明不同肝癌细胞株也具有特异的差异蛋白，这对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义.
这些组织特异性蛋白生物标记对我们从血清或组织标本中筛选或鉴定标志蛋白有重要意义，对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，更主要的是为研究肝细胞癌变机制提供了一个基础，而且这些蛋白有可能为肝癌治疗提供新的靶位，可以进行RNA干扰来阻断其高表达或通过基因导入来促进低表达蛋白的表达.
用Swiss蛋白数据库中检索分子量和pI值匹配的蛋白质发现Mr 11 084蛋白峰可能为钙结合蛋白S100 A10. S100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族, S100蛋白通过对钙离子的调节及与靶蛋白的相互作用,在体内发挥多种生物学功能. 研究发现 S100家族与肿瘤的发生发展关系密切,它们参与细胞周期调控，在多种肿瘤中表达异常,并与肿瘤的浸润、转移有关. S100 A10在肿瘤发生中的作用还不确定，它可能与Annexin II（p36）组成复合物，抑制p36磷酸化，参与细胞周期调控［8］. 在肝癌的发生中S100 A10可能通过p36起作用，它在肝癌细胞 HEPG2中低表达，抑制p36磷酸化的作用降低，从而抑制细胞增殖的作用降低，可能引起细胞生长失控而致癌.
从理论上讲，肝癌在发生、发展过程中其细胞内的蛋白质变化可以反应到血清中，可从体外培养的肝癌细胞株中筛选出部分与癌病人血清相一致的标志蛋白，有些改变可能只存在于细胞内而不分泌或代谢到细胞外，这部分蛋白可能是与癌症的发病密切相关的功能蛋白和调节蛋白.
目前，我们正进一步研究HBV感染携带者与HCC患者及正常人血清蛋白质的差异表达，结合体外培养细胞株的研究通过对比分析进一步筛选差异蛋白，下一步我们将蛋白纯化后进行序列测定，应用串联质谱分析鉴定特定的蛋白，以期确认肝癌的标志蛋白和功能蛋白，为临床肝癌的诊断提供新的思路，以期使肝癌的血清学诊断成为可能.
【参考文献】
［1］ Peng J, Gygi SP. Proteomics: The move to mixtures ［J］. J Mass Spectrom, 2001,36(10):1083-1091.
［2］ Robinson JC, Kerjan P, Mirande M. Macromolecular assemblage of aminoacyltRNA synthetases: Quatitative analysis of proteinprotein interaction and mechanism of complex assembly ［J］. Mol Biol, 2000,304:983-994.
［3］ Stoop AA,Jespers L, Lsters I, et al. High density mutagenesis by combined DNA shuffling and phage display to assign essential amino acid residues in proteinprotein interactions: Application to study structurefunction of plasminogen activation inhibitor 1(PAI1) ［J］. Mol Biol, 2000,301:1135-1147.
［4］ 丁守怡，钱冬萌，闫志勇，等. 蛋白质芯片飞行质谱技术检测体外培养的肝癌细胞株与转染HBV的肝癌细胞株蛋白质的差异表达［J］. 世界华人消化杂志，2005,13（14）:1684-1687.
［5］ Liotta LA, Kohn EC,Petricoin EF. Clinical proteomics: Personalized molecular medicine［J］ JAMA, 2001,286(18):2211-2214.
［6］ von Eggeling F, Davie
