【关键词】 酶动力学
Inhibitory effect of luteolin on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme in vitro
【Abstract】 AIM: To observe the inhibitory effect of luteolin on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme and to confirm the inhibitory type by its enzyme kinetic analysis in vitro. METHODS: Recombinant human protein kinase CK2 α′ and β subunits were cloned, expressed and purified. The 2 subunits were mixed at equal molar ratio to reconstitute CK2 holoenzyme. Luteolin inhibitory effect was detected by determining the radioactivity of 32P of ［γ32P］ ATP incorporated into the CK2 substrate and CK2 kinetic analysis was carried out by using the LineweaverBurk plot. RESULTS: Luteolin was proved to inhibit strongly the holoenzyme activity of recombinant human protein kinase CK2 with IC50 of 0.86 μmol/L. Kinetic studies of luteolin on recombinant human CK2 showed that luteolin acted as an inhibitor, competitive with ATP (Ki=0.19 μmol/L) and cooperative with casein (Ki=0.11 μmol/L). CONCLUSION: Luteolin is an effective inhibitor of protein kinase CK2 in vitro.
【Keywords】 protein kinase CK2; recombinant proteins; holoenzyme; luteolin; enzyme kinetics
【摘要】 目的：观察体外藤黄菌素对重组人蛋白激酶CK2的抑制效果及进行酶动力学分析以确定其抑制作用类型. 方法：利用基因工程技术进行克隆、表达和纯化，获得重组人CK2的α′及β亚基,并在体外等摩尔混合构成CK2全酶. 通过测定药物作用后转移到CK2底物上的［γ32P］ATP的32P的放射性活度来检测藤黄菌素对酶的抑制作用及采用LineweaverBurk作图法分析其动力学. 结果：藤黄菌素能显著抑制重组人蛋白激酶CK2的活性（IC50=0.86 μmol/L）. 酶动力学分析表明，藤黄菌素与ATP呈竞争性抑制CK2的活性（Ki=0.19 μmol/L）,与酪蛋白则呈混合性抑制CK2的活性（Ki=0.11 μmol/L）. 结论：藤黄菌素是一种较强的体外蛋白激酶CK2的抑制剂.
【关键词】 蛋白激酶CK2； 重组蛋白； 全酶； 藤黄菌素； 酶动力学
0引言
蛋白激酶CK2全酶是由2个催化亚基(α和/或α′)及2个调节亚基(β)所组成的异源四聚体，主要有α2β2,α′2β2或αα′β2 3种形式［1-2］，具有潜在的致瘤活性并与肿瘤的发生有着密切的联系［3］. 藤黄菌素(luteolin)可能会影响CK2的活性，因此我们选择藤黄菌素作为研究对象，在已克隆、表达和纯化人CK2α′及β亚基的基础上［4-5］，探讨其对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学，为进一步寻找新型的抗肿瘤和抗病毒药物奠定良好的基础.
1材料和方法
1．1材料藤黄菌素为Aldrich公司产品. 组蛋白ⅢS，多聚谷氨酸和酪氨酸复合物［Poly(Glu∶Tyr)4∶1］，肝素，精胺和ATP购自Sigma公司. 5，6二氯1β呋喃糖苯并咪唑(DRB)为Calbiochem公司产品. P81磷酸纤维素滤纸购自Whatman公司. ［γ32P］ATP为北京福瑞生物医学工程公司生产.
1．2方法人CK2α′和β亚基cDNA重组质粒pTCKA′和pTCKB的克隆与测序见文献［4］. 重组人CK2α′和β亚基的原核表达、纯化与鉴定见文献［4-5］. 蛋白定量：按常规的考马斯亮蓝G250染色法，以牛血清白蛋白作为标准. 蛋白激酶CK2的活性测定方法见文献［6］. 将纯化的重组人CK2α′与β亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2全酶. 在每个反应管中分别加入不同浓度的藤黄菌素10 μL，加入反应混合液15 μL，以全酶10 μL启动反应观察藤黄菌素对CK2全酶活性的影响. 根据半数效量概率单位法［11］ 计算IC50. 以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算IC50值(50%抑制时的概率单位为5). 根据IC50结果，选择3种浓度的藤黄菌素(0，1，2 μmol/L)进行分组. 在酪蛋白浓度为2 g/L，ATP浓度为10，20，40，80 μmol/L情况下测定CK2的活性；或在固定ATP的浓度为10 μmol/L，改变酪蛋白浓度(1，2，4，8 g/L)条件下测定CK2活性，每个样品同时做3个平行管, 采用LineweaverBurk作图法求出酶动力学参数表观Km和表观Vmax, 以此判断藤黄菌素对CK2抑制作用类型.
统计学处理：数据用SPSS 11.0统计软件处理，实验结果用x±s表示，多组资料采用oneway ANOVA分析，组间的比较用Dunnetts t检验. P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2．1重组人CK2全酶的性质将重组人CK2α′与β亚基等摩尔混合后构成的重组全酶，具有与天然CK2一致的性质，可用酪蛋白作底物；而用组蛋白ⅢS和TPK的底物Poly(Glu∶Tyr)4∶1作底物时，CK2的活性则很低（表1）. 另外，重组人CK2全酶的活性受到肝素和CK2特异性抑制剂DRB的抑制，精胺则有激活作用. 而一些第二信使分子，如cAMP，cGMP和Ca2+则对CK2的活性基本没有影响（表2）.
表1不同底物存在下测定的重组人蛋白激酶CK2全酶活性(略)
bP＜0.01 vs对照组. Poly(Glu∶Tyr)：多聚谷氨酸和酪氨酸复合物.
2．2藤黄菌素对重组人CK2全酶的直接作用向反应体系中加入0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，2.00 μmol/L藤黄菌素，其CK2活性占对照组CK2活性的百分数分别为(61.5±1.6)%，(54.1±0.6)%，(50.7±7.2)%，(46.4±5.6)%，(33.5±3.9)%，(15.9±4.3)%；提示藤黄菌素对重组人CK2全酶有较强的抑制作用，且随着藤黄菌素浓度的不断增加，CK2全酶活性逐渐降低，呈现浓度依赖性关系；直线回归方程为：Y=1.9987X-0.8502，r2=0.8203 (P＜0.05)；根据方程计算的IC50值为0.86 μmol/L.
表26种化合物对重组人蛋白激酶CK2全酶活性的影响(略)
bP＜0.01 vs对照组. DRB：5，6二氯1β呋喃糖苯并咪唑.
2．3在不同ATP浓度情况下藤黄菌素对CK2抑制作用的酶动力学分析在固定酪蛋白浓度、改变ATP的浓度条件下，进行藤黄菌素对CK2的酶动力学研究. 实验结果（图1）表明：在3种藤黄菌素浓度下，1/V对1/［S］作图的3个回归方程分别为：Y=0.237X+0.035，r2=0.936，P＜0.05（0 μmol/L藤黄菌素）；Y=1.235X+0.032，r2=0.978，P＜0.05（1 μmol/L藤黄菌素）；Y=3.542X+0.035，r2=0.998，P<0.01（2 μmol/L藤黄菌素）. 由此计算得出的相应表观Km分别为6.74，38.89和102.43 μmol/L；相应表观Vmax分别为28.57，31.25和28.57/nkat. 由此可以看出，随着藤黄菌素浓度的增加，表观Km值增大，而表观Vmax值则基本不变，双倒数作图的交点于纵坐标上，因此藤黄菌素与ATP对重组人CK2活性的抑制作用动力学属于竞争性抑制，根据这些数据计算的抑制常数Ki=0.19 μmol/L.
图1不同ATP浓度情况下LineweaverBurk作图法得出藤黄菌素对重组人CK2全酶抑制作用的动力学(略)
2．4在不同酪蛋白浓度情况下藤黄菌素对CK2抑制作用的酶动力学分析在固定ATP的浓度、改变酪蛋白浓度情况下，进行藤黄菌素对CK2的酶动力学研究. 实验结果（图2）表明：在3种不同的藤黄菌素浓度条件下，1/V对1/［S］作图的3个回归方程分别为：Y=0.007X+0.026，r2=0.927，P＜0.05（0 μmol/L藤黄菌素）；Y=0.056X+0.063，r2=0.999，P<0.01（1 μmol/L藤黄菌素）；Y=0.156X+0.134，r2=0.984，P＜0.01（2 μmol/L藤黄菌素）. 由此计算得出的相应表观Km分别为0.25，0.88和1.17 μmol/L；相应表观Vmax分别为38.46，15.87和7.46/nkat.
