作者：王凤岩，夏潮涌，黄中新，唐海兰，覃 莉，饶晓黎
【摘要】 目的 研究不同DNA干系倍体鼻咽癌细胞核的增殖活性。方法 鼻咽癌归档病例37例，要求每个病例包括正常鼻咽上皮组织和三个癌巢或肿瘤组织区域，免疫组化SP法进行PCNA与Ki-67染色，TIGER细胞图像分析仪分别检测每个癌巢或肿瘤区域的PCNA、Ki-67阳性表达率与DNA干系倍体。结果 同一癌巢或肿瘤区域的DNA干系二倍体的PCNA与Ki-67阳性表达率与DNA干系异倍体相比差异无显著性（P＞0.05）。结论 不同DNA干系倍体鼻咽癌的细胞增殖活性相同。
【关键词】 DNA干系倍体；细胞增殖；鼻咽癌；PCNA；Ki-67
Study the proliferation of DNA diploidy and DNA abnormal ploidy in nasopharyngeal cancer cells
【Abstract】 Objective To study the proliferation DNA ploidy in nasopharyngeal cellular nucleus.Methods 37 archival cases of nasopharyngeal carcinoma(NPC) were taken，each case contained the normal tissue and 3 cancer nests or region (in total 111 samples).The expression of PCNA and Ki-67 were examined by immunohistochemical SP method，DNA stem ploidy and the percent of PCNA，ki-67 positive cell nuclei were obtained by TIGER cell imagine analyzer.Results Compared with diploidy，the expression of PCNA and Ki-67 in abnormal ploidy were no statistical significance difference in the same net or carcinoma region (P＞0.05).Conclusion The prolifertion of DNA diploidy and DNA abnormal ploidy is equally in nasopharyngeal.
【Key words】 DNA stem ploidy； cell proliferation； nasopharyngeal carcinoma；PCNA； Ki-67
肿瘤细胞DNA含量及其干系倍体与肿瘤复发、转移及预后密切相关，研究表明DNA干系异倍体肿瘤的细胞增殖活性明显高于DNA干系二倍体的［1～3］。鼻咽癌是我国南部省区特异高发的一种恶性肿瘤，在国外比较罕见，有关鼻咽癌DNA干系倍体细胞的增殖活性鲜见报道，本文通过TIGER细胞图像分析仪，对37例鼻咽癌病例的DNA含量与干系倍体状况进行了分析，以PCNA 、Ki-67的阳性表达率反映细胞增殖情况，研究不同DNA干系倍体鼻咽癌细胞的增殖活性。
1 材料与方法
1.1 病例来源与组织切片的制备 暨南大学医学院附属第一医院1980～2000年鼻咽癌活检归档蜡块，术前均未进行放化疗，选择每个病例包括正常鼻咽上皮组织和三个癌巢或肿瘤区域，共37例，其中男29例，女8例，平均年龄49.1岁（18～82岁）。其中低分化鳞癌23例，泡状核细胞癌7例，未分化癌7例。每个病例制成4μm、8μm连续组织切片。
1.2 免疫组化染色及阳性表达率的计算 PCNA与Ki-67单克隆抗原均购自美国 DAKO公司，其余试剂均购自北京中山生物技术有限公司。4μm组织切片采用SP法，微波修复，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照；以淋巴结作为PCNA的阳性对照；以人乳腺癌作为Ki-67的阳性对照。使用TIGER细胞图像分析仪分别计数每个癌巢或肿瘤区域的阳性细胞核数与阴性细胞核数，计算每个癌巢或肿瘤区域的PCNA与Ki-67阳性表达百分率。
1.3 鼻咽癌细胞核DNA染色及其干系倍体的定量分析
1.3.1 Feulgen染色 4μm、8μm连续组织切片各1张，二甲苯脱蜡15＇×3.5 M HCl室温水解1h，Schiff’s试剂室温染色1h。
1.3.2 细胞图像分析仪的校正 使用显微测微尺标定TIGER细胞图像分析仪的几何标尺，使用中国计量科学院出产的标准密度片标定TIGER细胞图像分析仪的光密度。
1.3.3 鼻咽癌细胞核DNA含量及其干系倍体的定量分析 (1)8μm组织切片上以核距法测量鼻咽正常上皮细胞核与肿瘤细胞核体积等参数，具体方法参见文献［4］。(2)按柯勒氏照明要求调节OLYMPUS BX50显微镜的光源，在物镜（20×NA 0.5）与黑白摄像机之间插入535/35nm的带通滤光片。按TIGER细胞图像分析仪测量光密度的操作要求校正系统基准后，4μm切片（Feulgen染色）上测量正常鼻咽上皮细胞核与3个不同的癌巢或肿瘤区域细胞核的DNA光密度参数，具体方法参照文献［5］。(3)同样方法选取同一病例的正常鼻咽上皮非基底细胞核作对照。(4)TIGER细胞图像分析仪将4μm组织切片上测量所获得的光密度等参数与8μm组织切片上所获得的体积等参数进行计算，获得以单个完整细胞核体积为单位的体积积分光密度（VIOD），以正常上皮组织非基底细胞核的VIOD作内参照，计算每个癌巢或肿瘤区域的DNA指数。
1.3.4 DNA干系倍体的判定标准 以DI值判定DNA干系倍体。DI即DNA指数(DNA index，DI)，是指待测组织细胞核G0/1期DNA含量与正常二倍体细胞核G0/1期DNA含量之比。DI在1.0±0.2范围内，为DNA干系二倍体；其余为DNA干系异倍体，其中DI＜0.8 的为亚二倍体。
1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件包进行秩和检验。
2 结果
2.1 PCNA与Ki-67的阳性表达率 PCNA与Ki-67均定位于细胞核，细胞质不着色。检测的37例鼻咽癌病例111个标本中均有PCNA的阳性表达，各样本的阳性表达率在11.54%～70.28%之间。4例（10.81%）无Ki-67的阳性表达，99个样本的Ki-67阳性表达率在1.10%～46.14%之间，其中12个样本的阳性表达率大于20％。
2.2 鼻咽癌DNA干系倍体测量结果 DNA干系倍体以DNA指数（DI）表示，本实验共检测了37例鼻咽癌的111个癌巢或肿瘤区域的DNA干系倍体，DI在0.74～3.07之间，信捷职称论文写作发表网，按DI值将其分为三种类型，64个（57.66％）为DNA干系二倍体，47个（42.34％）为DNA干系异倍体，其中仅2个癌巢或肿瘤区域为DNA干系亚二倍体，结果见表1。
表1 111个鼻咽癌样本的DNA干系倍体
注：1中不包括DNA干系亚二倍体
2.3 鼻咽癌DNA干系倍体与细胞增殖状况的关系 以DI判定DNA干系倍体状态，PCNA、Ki-67阳性表达率判定鼻咽癌细胞核增殖状态。DNA干系二倍体的PCNA、Ki-67的阳性表达率与DNA干系异倍体比较差异均无显著性（P＞0.05）。
表2 不同DNA干系倍体的PCNA与Ki-67的阳性表达率 (x±s)
3 讨论
细胞在各种致瘤因素的作用下，基因发生突变，导致癌基因激活与抑癌基因失活及其编码产物的过度表达，使细胞在分裂增殖过程中出现染色体畸形、断裂、不分离以及基因扩增等，从而导致细胞核DNA的质或量发生异常改变，成为异常细胞群体。研究表明细胞核DNA含量与干系倍体的异常变化是其恶性改变的一项重要标志［6］，检测肿瘤细胞核的DNA干系倍体对恶性肿瘤的诊断、预后评估具有重要的指导意义。
由于同一细胞个体在不同细胞周期时相的DNA含量不同，而同一干系G0/G1期细胞核的DNA含量是恒定不变的，因此，定义正常二倍体细胞群体中G0/G1期细胞核的DNA含量为DNA干系二倍体，并以之为参照，计算被检组织中G0/G1期细胞核的DNA倍体，称为DNA干系倍体（DNA stemline ploidy）［7，8］。很显然，DNA干系倍体不受细胞群体中各细胞周期时相细胞比率的影响，在实际测量分析中更具有生物学意义。
本实验利用TIGER细胞图像分析仪分析了37例鼻咽癌111个癌巢或肿瘤区域的DNA干系倍体及其PCNA与Ki-67阳性表达率，结果显示DNA干系二倍体的PCNA与Ki-67的阳性表达率与DNA干系异倍体的差异无显著性。文献报道在乳腺癌与胃癌中DNA干系异倍体肿瘤细胞的增殖活性高于DNA干系二倍体的［2，3］；段秀梅等［9］使用流式细胞仪分析急性淋巴细胞性白血病DNA含量与细胞增殖活性时结果显示不同DNA干系倍体细胞的PI值相差无几。鼻咽癌在国外罕见，而国内有关不同DNA干系倍体肿瘤细胞增殖情况的相关报道也很少见，马骏等［10］报道使用流式细胞仪测得鼻咽癌DNA异倍体的S期分裂数及
