作者：项红军，窦科峰，王德盛，杨雁灵，刘正才，陈勇
【关键词】 肝肿瘤；受体,腺苷A2b；聚合酶链反应
【Abstract】AIM: To assess whether A2b adenosine receptor is differentially expressed in malignant tissues and evaluate A2b adenosine receptor level in hepatocellular carcinoma(HCC). METHODS: We determined the expression of A2b adenosine receptor protein by immunohistochemistry and Western blot and evaluated the expression levels of A2b adenosine receptor mRNA by using realtime quantitative PCR analysis in surgical samples of 38 HCC cases and in their paired adjacent noncancerous tissues. RESULTS: Immunohistochemistry showed a high expression of A2b adenosine receptor in human HCC. The levels of A2b adenosine receptor mRNA by realtime PCR in HCC were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.001). Weston blot analysis revealed the intensity of A2b adenosine receptor protein expression was constantly much higher in HCC than that in adjacent tissues normalized to βactin levels in an arbitrary unit. CONCLUSION: A2b adenosine receptor expression appeared upregulated in HCC, and it might be a new target molecule for HCC therapeutic strategy.
【Keywords】 liver neoplasms; receptor, adenosine A2b; polymerase chain reaction
【摘要】目的： 探讨腺苷A2b受体在肝癌组织及正常组织中的表达及其意义. 方法： 采用免疫组织化学染色方法检测腺苷A2b受体在肝癌及正常组织中的表达情况，Westernblot方法检测在肝癌组织及正常组织中蛋白水平的表达，定量PCR的方法检测肝癌组织及正常组织中mRNA的水平. 结果： 免疫组织化学结果显示腺苷A2b受体在组织切片肝癌组织中表达明显增高. Westonblot分析显示腺苷A2b受体蛋白表达强度相对于βactin水平，在肝癌组织中明显高于正常组织. 定量PCR结果显示肝癌组织中的mRNA水平明显高于邻近的正常组织. 结论： 本研究显示腺苷A2b受体的表达在肝癌组织中明显升高，腺苷A2b受体有可能成为新的抗肝癌的靶分子.
【关键词】 肝肿瘤；受体，腺苷A2b；聚合酶链反应
腺苷是腺嘌呤核苷酸代谢的中间产物. 在许多器官中当氧供应不足或需氧量增加时腺苷被释放至细胞外液中来调节能量供给和能量需要之间的平衡［1］，研究表明实质肿瘤的细胞外液中腺苷被发现有显著的升高. 腺苷通过四种膜受体A1, A2a, A2b和A3来调节许多生理过程［2］，其中A2受体被区分为高亲和力A2a和低亲和力A2b受体. 目前对于A2b受体的认识落后于其他的受体亚型，主要是由于A2b受体对于腺苷的相对低亲和力，认为与生理相关性很少. 最近发现A2b受体有很重要的功能，A2b受体的激活可能是肿瘤发展的一种新途经［3］. 本研究中我们探讨了腺苷A2b受体在肝癌组织中的表达及其意义.
1材料和方法
1.1材料38例肝癌及癌旁正常组织为我院近期切除的手术标本，所有肿瘤标本均经病理证实. 正常对照组织取自切除血管瘤周围组织，液氮中冻存. EnVision系统购自Gene Company Limited. BCA reagent kit购自Pierce公司. 腺苷A2b受体抗体购自Alpha Diagnostic International公司. TRIzol Reagent 购自invitrogen 公司. ThermoScriptTM RTPCR反转录试剂盒购自invitrogen 公司，Taq酶和DL2000购自宝泰克生物技术有限公司.
1.2方法
1.2.1免疫组织化学染色采用EnVision系统二步法. 脱蜡，水化组织切片. 预处理组织切片，酶修复或热修复. 滴加30 g/L H2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育10 min. 蒸馏水漂洗，置于PBS中10 min. 一抗孵育30 min. PBS漂洗10 min EnVision孵育30 min. PBS漂洗10 min DAB染色，光镜控制蒸馏水漂洗复染及封片.
1.2.2Westernblot样本组织加入600 μL 的RIPA真核细胞裂解液冰上充分研磨. 研磨液吸入1.5 mL离心管，4℃ 12000 r/min离心20 min，反复抽提10次. 将样品置于冰上10 min振荡1次，共振荡4次，最后4℃ 12000 r/min离心40 min，上清移入1.5 mL离心管，取5 μL样品稀释20倍后定量. 配120 g/L的电泳胶，每个样品上20 μg，积层胶120 V电压，浓缩胶160 V电压. 按照分子克隆的方法，100 V电压，转移2 h，将蛋白样品转移到硝酸纤维素（NC）膜，丽春红染膜，标出Marker，TBST洗膜，50 g/L的脱脂奶粉封闭1 h，加入 A2b抗体(1∶200)，4℃封闭过夜，TBST洗膜，10 min/次，共3次，加入二抗羊抗兔（1∶3000），室温封闭1 h，TBST洗膜，10 min/次，共4次，化学发光法检测.
1.2.3RNA提取及cDNA合成总RNA的提取依照TRIzol试剂盒说明书进行操作，所有的操作均在超净台中完成，分离出的RNA 溶于DEPC水储存在-70℃中备用. RNA反转录过程由oligo(dT)20 priming和ThermoScript RTPCR System完成. 将所有的样品稀释到 1 g/L. 取3 μL总RNA，1 μL Oligo dT，2 μL dNTP( 10 mmol/L )，6 μL DEPC水，混合均匀，65℃，5 min. 再加入4 μL 5×cDNA Buffer，1 μL DTT (0.1 mol/L)，1 μL Rnase OUT，1 μL DEPC水，1 μL ThermoScript混合均匀，50℃，信捷职称论文写作发表网，60 min. 再加热至85℃，5 min. 加入1 μL Rnase H，37℃ ，20 min，将样品放入-20℃ 保存备用. PCR反应体系如下：2.5 μL 10×PCR Buffer (MgCl2)，1.5 μL MgCl，2 μL dNTP，1 μL βactin上游，1 μL βactin下游, 1.5 μL cDNA模版, 0.5 μL Taq酶, 15 μL ddH2O, 总体积25 μL.. 反应温度如下：94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，25个循环，72℃ 5 min 4℃保存备用.
1.2.4定量PCR腺苷A2b受体的引物和探针来自ENSG00000170425(利用primer express软件产生). 其上游引物为5′TCCATCTTCAGCCTTCTGGC3′, 下游引物为5′AAAGGCAAGGACCCAGAGGA3′，荧光探针(FAM)为5′TGTGTCCCGCTCAGGTATAAAAGTTTGGTC3′. 看家基因βactin来自AB115328，上游引物为5′GCCCTGAGGCACTCTTCCA3′, 下游引物为5′GAAGGTAGTTTCGTGGATGCCA3′， 荧光探针(FAM)为5′CCTTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCT3′.
定量PCR过程由ABI Prism 7700序列检测仪完成（Perkin Elmer公司），实时PCR反应体系如下： 5 μL定量Buffer, 0.75 μL 10 mmol/L dNTP, 0.5 μL 250 mmol/L Mg2+, 0.5 μL 10 μmol/L上游和下游引物0.6 μL 5 μmol/L Taqman 探针, 0.25 μL Taq Polymerase(83.35 mkat/L), 2 μL cDNA模板，总体积25 μL. 95℃变性30 s，60℃退火延长30 s, 反应50个循环.
统计学处理： 结果以x±s表示，配对资料采用t检验.
2结果
2.1腺苷A2b 受体的表达免疫组织化学染色显示肝癌组织肝细胞膜和胞质中有阳性表达细胞, 呈黄色颗粒, 正常组织中染色的阳性细胞较少或无(图1).
2.2腺苷A2b受体蛋白水平表达A2b受体蛋白条带灰度值在肝癌组织中明显高于邻近正常组织(图2)， A2b受体蛋白水平相对于βactin水平在肝癌组织中明显高于邻近正常组织［(1.75±0.54) vs (0.77±0.13), P<0.01］.
2.3腺苷A2b 受体mRNA水平测定定量PCR结果显示肝癌组织中（3.05×106拷贝/g RNA）明显高于邻近正常组织(2.36×103拷贝/g RNA) (P<0.01）.
3讨论
在肿瘤的发生发展过程中, 不断进行新生血管化是肿瘤的一个重要特征，腺苷受体的上调和过表达与局部组织的血管发生有着特定的联系，研究表明腺苷受体家族与肿瘤的发生有着潜在的密切联系［4］. 但是A2b受体的作用机制仍未完全阐明，A2b受体分布在许多组织中，在腺苷浓度异常增高时A2b受体才能激活，特别是
