作者：郑力强，田蓉，李巍，付萌，邢影，王雷，顾伟杰，高天文，刘玉峰

【摘要】  目的： 探讨高滴度天然抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)对小鼠多器官系统的影响. 方法： AK auto Ab转基因小鼠及同窝对照小鼠于常规条件下饲养，观察小鼠体质量、生存时间等一般情况，Kaplan?Meier法绘制生存曲线. 取20周龄以上小鼠检测血常规和血生化值. 结果：与同窝对照小鼠相比，转基因小鼠体质量减轻(P<0.001)，生存时间缩短（P<0.05），脾肿大，肝脏、脾脏、肾脏与体质量的比值增大(P<0.05）；血常规显示白细胞数降低，淋巴细胞数下降（P<0.001）；血小板升高，血清总蛋白升高，尿素氮升高(P<0.05）. 结论： AK auto Ab的过度表达可能对小鼠的机体造成一定的损害，对多器官系统也产生重要的影响. 本研究对于全面分析天然自身抗体的功能具有重要的意义.

【关键词】  天然自身抗体；角蛋白；疾病；小鼠，转基因

　0引言
　　
　　天然自身抗体（Natural auto?antibodies, NAA）广泛存在于正常人和多种动物体内，具有抗感染、免疫调节、肿瘤监视、维持内环境稳定等多方面的功能［1-2］，对机体具有重要的保护作用. 然而随着对NAA功能研究的进一步深入，大量证据发现，NAA具有潜在的病理意义［1-4］. 那么NAA对机体到底有利还是有害呢？目前尚无明确结论，这也是目前免疫学及相关学科关注的热点问题. 我们在前期工作中建立了天然抗角蛋白自身抗体(anti?keratin auto antibody, AK auto Ab)转基因小鼠，发现其具有增高的血清AK auto Ab滴度，为进一步研究AK auto Ab的功能提供了良好的模型. 我们长期观察了饲养于常规条件下的转基因小鼠及同窝对照小鼠，对20周龄以上小鼠的生理情况进行深入研究和分析，为明确NAA的病理意义进行积极的探索.

　　1材料和方法

　　1.1材料AK auto Ab 重链转基因小鼠由本室李巍博士建立［5］，在本校动物中心常规条件下饲养. 主要仪器包括全自动生化仪(COBAS INTEGRA 400)，血球分析仪(Medonic CA620?VET). 

　　1.2方法对照观察了37对小鼠的生存时间，23对小鼠的体质量、脏器体质量比. 分析了18对小鼠的血常规及血生化改变：取尾静脉血25 μL，稀释液（含抗凝剂）稀释500倍后全自动血球分析仪检测血常规，总共20项指标；摘除小鼠眼球取血，分离血清，全自动生化分析仪检测总蛋白、白蛋白、血糖、血尿素氮、血肌酐共5项.

　　统计学处理：用SPSS13.0统计软件分别对计量资料和计数资料进行配对t 检验，Kaplan?Meier法绘制生存曲线，Log rank检验进行生存率比较. P<0.05即认为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　本研究在前期工作中获得了3系具有较高血清AK auto Ab滴度的转基因小鼠，每系均具有相似的表型，本文展示的是39系小鼠的表型改变.

　　2.1一般情况及体质量在20 wk前，转基因小鼠与同窝对照小鼠无明显差别. 20 wk左右以后，转基因小鼠逐渐出现病态表现：明显消瘦，弓背畸形，摄食减少，体毛皱褶，活动能力差（图1）. 转基因小鼠体质量减轻，与同窝对照小鼠相比具有统计学意义(P<0.001). 15对雌性小鼠中转基因小鼠体质量(17.24±2.79) g，对照小鼠为(24.64±3.95) g，8对雄性小鼠中转基因小鼠体质量(19.61±1.83) g，对照小鼠为(24.95±4.79) g，雌性小鼠的体质量减轻比比雄性更加明显.

　　Tg：转基因小鼠；WT：同窝对照小鼠.

　　图1转基因小鼠与同窝对照小鼠的大体图片（略）

　　Tg：转基因小鼠；WT：同窝对照小鼠.
 
　　图2转基因小鼠与同窝对照小鼠的脾脏比较（略）

　　2.2脏器质量与体质量比转基因小鼠的脾脏明显增大(图2)，脾脏、肝脏、肾脏与体质量比增加且有统计学意义（n=23, t值分别为2.36, 2.62, 2.40，P均<0.05，图3）.

　　2.3生存率与同窝对照小鼠相比，转基因小鼠生存曲线较低，生存时间缩短，Log rank检验显示生存率差异有统计学意义(n=37, P<0.05, 图4）.

　　图3转基因小鼠与同窝对照小鼠脏器与体质量比（略）

　　图4生存曲线（Kaplan?Meier法绘制）（略）

　　2.4血常规转基因小鼠血小板（PLT）计数升高(t=2.71)，淋巴细胞（LYMF）绝对值降低(t=6.86)，白细胞（WBC）总数降低(t=5.20)，中性粒细胞（GPR）百分比升高(t=5.25)，血小板压积（PCT）增大(t=2.69,表1).

　　2.5血清生化转基因小鼠总蛋白(TP)升高(t=3.56)，尿素氮(BUN)升高(t=2.58)，血糖(GLU)降低(t=4.91)；而血肌酐(CRE)和白蛋白(ALB)无统计学意义(表2).

　　表1转基因小鼠与同窝对照小鼠血常规检测结果比较（略）

　　aP<0.05,  bP<0.001 vs Tg.  Tg：转基因小鼠，WT：同窝对照小鼠.

　　表2转基因小鼠与同窝对照小鼠血清生化值（略）

　　aP<0.05,  bP<0.001 vs Tg. Tg：转基因小鼠，信捷职称论文写作发表网，WT：同窝对照小鼠.
　　
　　3讨论
　　
　　AK auto Ab作为天然自身抗体家族中的成员之一，广泛存在于正常人和脊椎动物体内，参与机体的多种生理和病理过程［1-4］. 抗角蛋白自身抗体3B4重链转基因鼠的构建成功为对其功能的深入研究提供了良好的平台［5］.

　　我们通过对高滴度抗角蛋白抗体3B4转基因小鼠的观察和分析，发现转基因小鼠容易发生消瘦，弓背畸形，摄食减少，体毛皱褶，活动能力差等表现，而且生存率明显下降，脾肿大，肝脏、脾脏、肾脏与体质量的比值增大. 血小板升高、白细胞降低、淋巴细胞下降；总蛋白升高、尿素氮升高；此外，从性别上看，患病率也有差异，雌性鼠的患病率大约是雄性鼠患病率的两倍，以上的临床表现与Khare等［6］和Wiekowski等［7］报道的转基因小鼠有很多相似之处.  其结果也表明： AK auto Ab的过度表达可能对小鼠的机体造成一定的损害，对多器官系统也产生重要的影响，然而对于脾脏、肾脏等重要脏器的异常表现，仍需做进一步的研究.
　　
　　在某些特殊的条件下，自身免疫性疾病可能源于天然的、生理的免疫调节失调，天然自身抗体也能产生致病性的自身抗体(独特型抗体)，引起了免疫网络调节的失衡，从而导致自身免疫性疾病的发生［1-2］. 本实验初步的研究结果提示了天然自身抗体的高表达可能引起机体免疫网络调节的失衡，对于全面分析天然自身抗体的功能具有重要的意义.

【参考文献】
  　　［1］ Lacroix?Desmazes S, Kaveri S, Mouthon L, et al. Self?reactive antibodies (natural autoantibodies)in healthy individuals［J］. J Immunol Methods, 1998,216:117-137.

　　［2］ Quintana FJ, Cohen IR. The natural autoantibody repertoire and autoimmune disease ［J］. Biomed Pharmacother, 2004,58:276-281.

　　［3］ Ochsenbein AF, Zinkernagel RM. Natural antibodies and complement link innate and acquired immunity ［J］. Immunol Today, 2000,21:624-630.

　　［4］ Fossati?Jimack L, Reininger L, Chicheportiche Y,et al. High Pathogenic Potential of Low?Affinity Autoantibodies in Experimental Autoimmune Hemolytic Anemia ［J］. J Exp Med, 1999, 190:1689-1696.

　　［5］ 李巍，韩骅，邢影，等. 高滴度天然抗角蛋白自身抗体转基因小鼠模型的建立［J］. 中华皮肤科杂志,2005,38:759-761.

　　［6］ Khare SD, Sarosi I, Xia XZ, et al. Severe B cell hyperplasia and autoimmune disease in TALL?1 transgenic mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 3370-3375.

　　［7］ Wiekowski MT, Leach MW, Evans EW, et al. Ubiquitous Transgenic Expression of the IL?23 Subunit p19 Induces Multiorgan Inflammation, Runting, Infertility, and Premature Death［J］. J Immunol, 2001,166:7563-7570.