作者：田蓉，李巍，于继云，刘玉峰
【关键词】 树突细胞
In vitro culture and characterization of mouse spleen dendritic cells
【Abstract】 AIM: To explore and optimize the methods for in vitro culture of mouse dendritic cells (DC) that were then observed morphologically and identified biologically. METHODS: Mice were injected with 200 mg/kg cyclophosphamide through the tail vein, and were sacrificed 8 d later. Spleen cells were cultured with ordinary methods firstly, and 3 d later conditional medium containing IL4, GMCSF was added, and TNFα was added at day 5. At day 8, cells were subjected to phasecontrast microscope, scanning electron microscope, and transmission electron microscope analysis. At day 3, 5, 7, cells were subjected to FACS for detection of cell surface markers. RESULTS: Cultured cells displayed a typical DC phenotype in morphological analysis, and FACS showed these cells expressing such DC markers as CD11c, CD86,ⅠAb, H2D6. CONCLUSION: Using of IL4, GMCSF, TNFα as stimulators in the mouse spleen cell culture can obtain DC with high quality and high purity, which makes a foundation for future research on the basic and clinical usage of DC.
【Keywords】 dendritic cells; cytokines; MHCⅡ molecule
【摘要】 目的： 探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞（DC）的方法，并进行形态学观察和生物学鉴定. 方法： 应用环磷酰胺200 mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠，8 d后处死小鼠，常规培养脾细胞，第3日加入含有IL4, GMCSF细胞因子的条件培养液，第5日补加TNFα,第8日制备标本进行相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，并分别在培养第3, 5, 7日经流式细胞仪检测成熟细胞表面标志. 结果： 刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，具有典型的DC形态，流式细胞仪检测发现细胞表面表达CD11c, CD86, ⅠAb, H2D6标志物. 结论： 在小鼠脾脏细胞培养中加入IL4, GMCSF, TNFα等刺激，可获得足量、较高纯度的DC，为DC的基础研究与临床应用奠定了基础.
【关键词】 树突细胞；细胞因子；MHCⅡ类分子
0引言
自从Steinman等于1973年发现树突状细胞（dentritic cell, DC）以来［1］，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞，其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的能力，日益引起国内外学者的关注. 特别是DC与肿瘤免疫的密切关系以及在抗肿瘤方面的独特功能，使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域. DC来源于骨髓CD34+细胞［2］，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，然而DC在体内分布散在，含量极低，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%. 目前体外培养DC的方法尚不尽人意，在很大程度上限制了对DC基础和临床工作的开展. 我们在体外培养扩增了Balb/c小鼠的DC细胞，在培养中添加IL4, GMCSF, TNF等刺激，并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分析对所培养细胞进行鉴定，为优化DC的体外培养方法进行积极的探索.
1材料和方法
1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司；荧光标记抗体： CD11cFITC, IAbFITC, H2DbFITC, CD86FITC购自Diaclone公司；rmGMCSF, rmIL4, TNFγ，胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶购自美国GIBCOL公司；Hepes，青霉素，链霉素购自美国Sigma公司；倒置相差显微镜为日本Olympus公司生产，低速离心机为北京医用离心机厂生产，微量台式高速离心机为德国Heraeus公司生产，流式细胞仪为Coulter公司生产，扫描电镜、透射电镜由美国BD公司生产；6~8 wk龄雄性Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心.
1.2方法
1.2.1DC细胞的分离与培养将环磷酰胺按200 mg/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8 d后颈椎脱位处死小鼠，750 mL/L乙醇浸泡10 min，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎、研磨后收集滤过的细胞悬液，离心800 r/min, 7 min，加TrisNH4Cl 3 mL，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1×109 /L细胞，37℃，50mL/L CO2孵箱培养. 3 d后，吸弃全部培养基及悬浮细胞，加rmGMCSF/rmIL4条件培养基隔日半量换液，第5 d补加细胞因子TNFγ 1 mg/L，第7 d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日收集悬浮的细胞即为富集的DC. 相差显微镜下观察细胞形态特点.
1.2.2扫描电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，接种放置在培养皿中的盖玻片上，37℃， 50 mL/L CO2孵箱培养. 待细胞汇合，取出盖片，浸入PBS漂洗细胞表面；将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的40 mL/L戊二醛，在4℃固定2 h，吸出固定剂，PBS浸洗2次，每次10 min，再用4℃预冷的10 g/L锇酸固定，在4℃固定1 h，然后用PBS浸洗2次，每次10 min；用系列梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，扫描电镜观察细胞表面结构.
1.2.3透射电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，PBS洗涤，细胞沉淀用40 mL/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，包埋，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察细胞超微结构.
1.2.4细胞表面标记FACS分析分别收集培养第3, 5, 7 d的细胞，离心800 r/min, 7 min，弃上清，用含20 mL/L牛血清的PBS洗液1 mL洗涤2次，分别加终浓度为5 mg/L的标记抗体1 μL（CD11cFITC, IAbFITC, H2DbFITC, CD86FITC）. 设阴性对照组. 4℃轻度震荡30 min；再用PBS 1 mL洗液洗涤2次；间标抗体再加入FITC标记羊抗鼠lgG, 100 μL/管，终浓度为5 mg/L，4℃避光轻度震荡30 min， PBS 1 mL洗液洗涤2次，信捷职称论文写作发表网，加10 g/L多聚甲醛400 μL固定，上流式细胞仪检测.
2结果
2.1DC的分离与培养经尾静脉注射环磷酰胺的小鼠，饲养8 d后，脾脏明显增大，为正常小鼠脾脏体积的3倍左右，脾细胞数平均7.5×107/只. 镜下观察细胞体积较大、均匀、圆形，加入GMCSF 20 μg/L, IL4 1 μg/L体外培养3 d后，增殖出大量悬浮的粒细胞及疏松黏附于贴壁单核细胞上的增殖性细胞集落. 第8日收集已脱落的及疏松黏附的细胞集落，即为富集DC.
2.2相差显微镜观察培养7 d的DC，相差显微镜下可见较大体积的悬浮细胞，具多形性，贴壁时有细长突起，“呈树突状”，悬浮时向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，呈“刺猬状”，部分伸展为不规则状（图1）.
图1培养DC的相差显微镜观察×100（略）
2.3扫描电镜观察培养7 d的DC，扫描电镜下可见细胞伸展出大量大小不一、扁平的胞质突起，末端圆钝，细胞膜光滑无皱折（图2A）.
2.4透射电镜观察培养7 d的DC，透射电镜DC胞体周围可见不规则突起和褶皱；胞核染色深，偏向一侧，形状不规则，多为分叶状；胞质线粒体较为丰富，较多吞饮大泡及小泡，高尔基体、溶酶体少. 所培养细胞具有典型的DC形态特征（图2B）.
A： 扫描电镜；B： 透射电镜.
图2培养DC的电镜观察×1000（略）
2.5细胞表面标志FACS鉴定应用流式细胞仪分析体外培养第3, 5, 7日，及补加细胞因子TNFγ后第7 d的DC表面标志显示： N418（CD11c）细胞比例分别为16.22%, 13.54%, 34.37%, 78.16%; MHCII（Iab）细胞比例分别为28.80%, 21.88%, 25.85%, 58.45%; MHCI类（H2Db）细胞比例分别为4.82%, 2.46%, 11.94%, 24.635; B72（CD86）细胞比例分别为77.89%, 59%, 75.71%, 80.59%; 随着细胞成熟，MHCI类分子、MHCII类分子、共刺激分子的表达逐渐增高，加入TNFγ后，所测DC各表面标
