3讨论

　　DC在组织中分布广，但含量极少，因此建立成熟的DC体外培养技术获得足够数量的有功能的DC就显得非常重要［3］. 1992年，Steinman实验室首先建立了用GMCSF从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法，目前，小鼠DC的来源仍主要采用这种方法. 但新近研究表明［4］，如果应用亚致死量化疗或放疗药物处理小鼠，使DC前体细胞重新定位于脾脏，在特定的造血环境下扩增，再取出以GMCSF或GMCSF+IL4培养，就能扩增出大量DC，且具有产量大、纯度高、稳定性高、操作简便等特点. 在上述工作基础上，本实验予高剂量（200 mg/kg体质量）环磷酰胺经尾静脉注射小鼠，8 d后可见小鼠脾脏显著增大，此脾细胞经GMCSF （20 μg/L）+ IL4（μg/L）培养，第5日补加细胞因子TNFγ，第8日，获得了大量淋巴系DC，每只小鼠平均可得7.5×107细胞数，较文献报道细胞数高. 将培养细胞悬液在相差显微镜及电镜下观察，发现所培养细胞具有典型的DC形态特征，均明显有别于单核细胞和巨噬细胞［5］.
 
　　DC的发育、成熟与其在体内的迁徙过程和细胞表面标记的变化之间的复杂关系，是其重要的生物学特点［6］. DC并不是一个均一的群体，但所有的DC均来源于骨髓干细胞，不论是组织DC还是培养DC，不论是人DC还是小鼠DC，均可区分为非成熟和成熟两个阶段［7］. 非成熟DC主要位于易与外来抗原接触的外周器官，细胞表面较高表达与吸收和加工抗原有关的分子，如CD1A，CCR6；而当DC细胞完成抗原加工功能，向次级淋巴器官迁徙的过程中，那些影响DC细胞迁徙、提呈抗原、激活T细胞的趋化因子、黏附分子、MHCI类分子、MHCII类分子及共刺激分子，包括CD1, CD4, CD33, CD40, Iab, H2Db, CD80 （B71），CD86（B72）等的表达逐渐增加，最终，DC转变成为能够专职递呈抗原、发挥免疫功能的成熟DC［8-9］. 我们分别收集所培养第3, 5, 7日及补加细胞因子TNFγ后第7日的DC，应用流式细胞仪分析细胞的表型，结果显示所培养的DC已表达了主要表面标记，并随时间变化总体呈现上升趋势，在培养第5日有所降低，但到第7日时，均明显升高，由于所测表面分子均为成熟DC主要的标记，所以表型的变化规律基本符合DC的成熟过程. 培养DC表面这些分子的升高或较高比例的表达，表明其已成为有可能发挥功能的抗原递呈细胞.
 
　　另外，我们注意到，在培养第5日补加细胞因子TNFγ后，DC表面的标记分子明显上升，这进一步证实了TNFγ在DC发育、成熟中的作用. 可能的机制为：TNF作为第一信号，可上调并维持干细胞的GMCSFR，抑制干细胞朝粒系转化；上调的GMCSFR在接受GMCSF的刺激后，进一步朝DC方向发展. 实验结果中有些标记分子的表达比预期的以及理论上的表达量低，可能是由于体外培养DC的各种环境和条件与体内还存在着不同以及操作上的某些差异造成的，但结合细胞形态及表面标志物整体分析，本实验已培养出了具备典型成熟DC特征的细胞，为进一步探讨DC体外对T淋巴细胞的激活作用及抗瘤作用奠定了基础.

　　【参考文献】

　　［1］   Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in perpheral lymphoid organs of mice I. Morphology, quantitation, tissue distribution ［J］. J Exp Med, 1973,137(5):1142-1162.

　　［2］   Kleindienst P, Brocker T. Endogenous dendritic cells are required for amplification of T cell responses induced by dendritic cell vaccines in vivo ［J］. J Immunol, 2003,170(6):2817-2823.

　　［3］   Crespo I, Paiva A. Immunophenotypic and functional characterization of cord blood dendritic cells ［J］. Stem Cells Dev, 2004,13(1):63-70.

　　［4］   Pospisilova D, Borovickova J. Methods of dendritic cell preparation for acute lymphoblastic leukemia immunotherapy in children ［J］. Med Oncol, 2005,22(1):79-88.

　　［5］   Sandell MH. Dadabayey AR. Prognostic value of tumorinfiltrating dendritic cells in colorectal cancer: Role of maturation status and intratumoral localization ［J］. Clin Cancer Res, 2005,11(7):2576-2582.

　　［6］   Andersson BU, Tani E. Prognostic value of tumorinfiltrating dendritic cells in colorectal cancer: Role of maturation status and intratumoral localization ［J］. Clin Cancer Res, 2005,11(7):2576-2582.

　　［7］   Hamada I, Kato M. Clinical effects of tumorassociated macrophages and dendritic cells on renal cell carcinoma ［J］. Anticancer Res, 2002,22(6C):4281-4284.

　　［8］   Hajek R, Butch AW. Dendritic cell biology and the application of dendritic cells to immunotherapy of mμLtiple myeloma ［J］. Med Oncol, 2000,17(1):2-15.

　　［9］   Avigan D. Fusions of breast cancer and dendritic cells as a novel cancer vaccine ［J］. Clin Breast Cancer, 2003, 3 （Suppl 4）: S158-S163.