2 伯氏疟原虫的DNA疫苗
Leitner等[12]用两个表达伯氏疟原虫CSP(PbCSP)水平不同的质粒DNA分别经表皮或肌肉免疫注射BALB/c小鼠，结果表明，延长免疫间隔时间不仅可使抗体的产量增加，而且可增强免疫保护作用。而在经表皮注射的动物中，发现该质粒DNA还可促进CSP特异性IgG同种型IgG1和IgG2a转换，最终两者达到平衡。用基因枪法将高表达质粒经表皮3次免疫动物，每次间隔6周，结果诱导出强烈的体液免疫应答及高水平的保护作用。Gramzinski等[13]用编码用PyCSP的质粒DNA免疫夜猴以进行优化抗体应答方面的研究，结果表明，经皮内途径免疫诱导产生的抗体应答水平与多种抗原肽/佐剂疫苗相似。因此，在夜猴模型中，可应用皮内注射途径进行DNA疫苗的初期研究。同时也表明，该途径适合于诱导针对恶性疟原虫抗原的保护性应答的DNA疫苗研究。
3 恶性疟原虫的核酸疫苗
恶性疟原虫子孢子表面蛋白2(PfSSP-2)是一种表达于子孢子及红外期疟原虫膜表面的抗原，也是保护性免疫应答的一种靶抗原。在体内，过继转移PfSSP-2特异的CD8+T细胞可传递对攻击感染的保护作用。用表达PfSSP-2的肥大细胞瘤细胞被动转移也可传递来自CD8+T细胞的保护作用[14]。
Wang等[15]将分别编码恶性疟原虫PICSP、子孢子表面蛋白-2(PfSSP2)、红外期蛋白(PfEXP2)及肝期蛋白-1(PfLSA1)基因的质粒DNA混合物或编码单一蛋白基因的质粒DNA肌肉注射免疫恒河猴。如果，PfCSP质粒DNA免疫的所有6只猴、PfSSP2质粒DNA免疫的9只猴中的7只、PfEXP2或PfLSA1质粒DNA免疫的6只猴中的5只，它们的外周血单核细胞(PBMC)在体外经抗原刺激均可检测到抗原特异的CTL，且CTL活性受遗传限制，并依赖于CD8+T细胞。本研究首次证明了质粒DNA混合物免疫的灵长类可诱导出针对混合物中所有组分的CD8+T细胞应答，可为人类的多核酸免疫提供基础资料。
Butler等[16]报道了一项临床试验，用疟原虫CSP基因构建的核酸疫苗与佐剂QS21混合，接种免疫志愿者，结果7名经感染有疟原虫的蚊反复叮咬的志愿者中，有6人获得了保护，证实了核酸疫苗的免疫保护效果。
Wang等[17]用编码疟原虫抗原蛋白的质粒DNA免疫注射疟原虫未感染的志愿者，结果表明，该疫苗可诱导出抗原特异的、基因限制的CD8+依赖的CTLs，且这种免疫应答受6个HLA1型等位基因的限制。本研究首次证明DNA疫苗可诱导未感染健康人产生CD8+CTLs。同时也证明在同一个体中，CTLs受多个HLA等位基因限制。这些证据将为这种革命性疫苗技术用于人体的进一步研究提供基础资料。
4 优化疟疾DNA疫苗的策略
4.1 优化免疫方案
核酸疫苗在诱导体液应答、CTL应答及保护作用的免疫途径、剂量、次数及其间隔等仍未得到解决，但它们都可能影响核酸疫苗的免疫效果。正如Sedegah等[6]在PyCSP dNA疫苗免疫的试验中，发现抗体的应答水平大约与质粒DNA剂量成正比，而且PyCSP质粒DNA疫苗经2－3次免疫(间隔2－3周)可诱导出对子孢子攻击感染的保护作用，若再进行第四次免疫，结果可引起Th1型免疫应答向Th2型免疫应答转化。除上述影响因素外，研究还发现动物的发育程度也能影响疫苗的效果。Mor等[18]将具有保护作用的质粒DNA[6]用来免疫2－5日龄小鼠，发现它们不仅不能诱导免疫效应，反而诱导了免疫耐受。这种新生期免疫耐受的动物体内经DNA疫苗再次免疫无法诱导出抗体、细胞因子或细胞毒应答。这种耐受特异针对由核酸疫苗编码表达的内源性抗原的免疫原表位，信捷职称论文写作发表网，而经外源CSP免疫的小鼠可产生针对不同表位的抗体，而不发生免疫耐受。这些结果表明，与传统的蛋白免疫原相比，DNA疫苗诱发的免疫应答在性质、特异性方面有着明显的差异。
4.2 改善DNA疫苗的载体
DNA疫苗研究的最终目的在于利用它来保护人体以抵抗疟原虫感染，因此安全性显得非常重要。为避免外源基因整合进人体细胞染色体中，研究人员在构建载体时将一些病毒DNA序列如SV40的复制起始点剔除掉。同时也可插入一些有利于靶抗原基因表达的序列，如Haddad等[19]构建了可编码疟疾抗原Pf322的质粒DNA，同进在此质粒DNA中编码靶抗原基因的前方插入人体组织纤溶酶激活物(tPA)信号序列。首先在体外分别用含有或缺乏tPA信号序列的质粒DNA转染COS细胞，并用布雷菲尔德菌素A处理转染子。结果表明，只有编码有信号肽的质粒转染的细胞通过质内网和Golgi体通路分泌靶抗原。分别用这种质粒重复肌肉注射小鼠，结果诱发的针对靶抗原的抗体应答在动力学、特异性IgG水平及持续时间上都有明显的区别，这些结果提示，这两种质粒体内转染肌肉细胞产生的B细胞可识别及抗原提呈细胞(APC)可摄取的靶抗原水平也明显不同。
4.3 修饰抗原序列以改变抗原表达的定位及免疫原性
改变DNA疫苗抗原表达的定位可用于改变该抗原的免疫原性。现代免疫学研究已经证明，非分泌性抗原必须通过MHCⅠ类途径优先处理和提呈才能激发CD8+T细胞介导的免疫应答，而分泌性抗原只能通过促进APC摄取以及MHCⅡ类途径提呈从而诱发体液应答。另外，也可通过改变抗原的氨基酸序列改变抗原免疫原性[20]。
4.4 免疫应答的改变
优化免疫应答可通过如下方法进行，应用编码有细胞因子或协同刺激因子的质粒来调控免疫应答。Weiss等[21]分别构建了编码PyCSP基因的质粒DNA——PyCSP1012和鼠CM-CSF基因的质粒DNA。结果发现，单独以PyCSP1012免疫小鼠，其保护率为28％；与GM-CSF质粒DNA同时免疫则保护率可提高到58％；与编码无活性的GM-CSF的质粒DNA同时免疫则不能提高其保护性；而GM-CSF质粒DNA单独免疫也没有保护性。GM-CSF质粒DNA在PyCSP1012免疫中的免疫促进作用表现为，它可提高PyCSP的IgG1、IgG2a及IgG2b的产量，而不能促进IgG3或IgM的产生；同时它也可增强CD8+T细胞针对PyCSP280－288aa表位的IFN-γ应答增强，但CTL活性没有发生变化。最引人注目的是，PyCSP1012质粒DNA和GM-CSF质粒DNA同时免疫可提高抗原特异的IL-2的产量，并促进抗原特异CD4+T细胞的增生，提示GM-CSF质粒DNA可能作用于树突状细胞进而促进PyCSP抗原的提呈，然后IL-2产量的增加及CD4+T细胞活性增强促进了抗体和CD8+T细胞的功能。重组GM-CSF已应用于人体的临床治疗，因而GM-CSF蛋白或其质粒DNA可用作DNA免疫的一种增强剂。
5 结 语
DNA免疫技术为疟疾疫苗的研制开拓了一条前所未有的新途径。自此项技术应用于疟疾核酸疫苗的研制后，在短短的几年间，已有多种DNA疫苗使用于动物模型的研究，并可诱导出CD8+T细胞应答。研究表明，用二价DNA疫苗或多价疫苗或多种单价疫苗联合免疫有可能克服远交系动物因遗传背景而限制的免疫应答。尽管如此，在设计与构建能诱导保护性免疫应答的核酸疫苗方面尚存在许多问题。从疟疾基因组计划[22]可获得许多基因的信息，并很快在DNA疫苗研制中得到了应用
