作者：武永康，董 伦，刘华伟，申林海
【摘要】 目的 研究放线菌素D（Actinomycin D，ACTD)和替尼泊苷（Teniposide，VM-26)对大鼠胶质瘤细胞增殖的体内治疗效果。方法 将野生型的C6鼠胶质瘤细胞接种于鼠脑右侧尾状核（对照组10只，空载组10只），并对鼠脑内已形成的C6胶质瘤分别用ACTD及VM-26抗瘤缓释剂瘤区原位注射（治疗组各10只）。观察各组大鼠的一般情况、生存期、肿瘤病理学和磁共振成像（MRI）动态改变，采用PCNA计数、TUNEL法检测肿瘤细胞增殖活性及凋亡。结果 对照组及空载组大鼠平均生存期为19.3天，ACTD组6只及VM-26组3只大鼠生存期明显延长，存活期超过200天；除因病理检查人为处死各2只外，ACTD组治疗后4周内死亡2只，VM-26组5只。MRI检查对照组大鼠脑内有明显瘤灶，治疗组大鼠脑内瘤灶治疗后明显减少或消失，均与病理学检查结果一致，而且治疗组大鼠C6细胞增殖活性降低，大量细胞凋亡，ACTD较VM-26显著。结论 ACTD可望成为体内局部应用治疗胶质瘤的优选化疗药物。
【关键词】 放线菌素D；替尼泊苷；神经胶质瘤；体内；化疗
【Abstract】 Objective To study the therapeutic effect of ACTD and VM-26 on rat C6 glioma in vivo.Methods Wild type C6 cells were implanted stereotaxically to the caudate nucleus of right cerebrum of Wistar rats(control and empty loading group，10 rats respectively)，and rats with cerebral tumor foci were treated ACTD and VM-26 mediated by delayed release retarder (treated group，10 rats respectively).The general manifestation，survival time，MRI features，histopathological change，proliferation activity and apoptosis of the glioma in each group of rats were observed.Results The mean survival time of control animals was 19.3 days.Two ACTD or VM-26 treated rats were killed on day 28 and 58 after implantation for histopathological examination.The surviving time of the 9 remaining rats(6 ACTD and 3 VM-26 treated rats)was over 200 days.MRI demonstrated a distinct cerebral tumor in control rats，but the tumor foci were disappeared almost completely in the treated rats.The cerebral glioma of rats after the treatment with ACTD showed decrease in proliferation activity and apoptosis，significantly decrease than the treatment with VM-26.Conclusion The results of ACTD in treatment of rat C6 glioma is encouraging.It can be used as the chemotherapy for human malignant glioma.
【Key words】 ACTD；VM-26；glioma；in vivo；chemotherapy
我们以往的研究结果表明，放线菌素D(Actinomycin D，ACTD)可显著抑制C6鼠胶质瘤细胞恶性增殖诱导细胞凋亡，在4个不同的浓度对比中ACTD的抑瘤作用均强于替尼泊苷(Teniposide，VM-26)，凋亡率在大剂量ACTD时的作用明显优于VM-26［1］。为进一步明确二者对恶性胶质瘤化疗疗效，我们研究了C6细胞接种于鼠脑的致瘤性以及对鼠脑内已形成瘤灶的C6胶质瘤应用ACTD及VM-26的抗瘤缓释剂瘤区原位治疗的疗效，观察大鼠的一般情况、生存期、肿瘤体积变化以及肿瘤病理组织学与细胞生物学特征变化。
1 材料与方法
1.1 实验材料 C6鼠胶质瘤细胞系由中国科学院动物所提供。细胞培养基：DMEM （Dulbecco modified eagle medium Gibco，USA)，小牛血清（Hyclone，USA)。主要生化试剂：将消毒后的医用明胶10g加入注射用水50ml，分别加入ACTD 0.1g及VM-26 0.5mg，搅拌成半流状，制成抗瘤缓释剂。原位细胞凋亡检测试剂盒（Roche，Germany)，ABC免疫组化试剂盒及抗体（北京中山及其代理的Santa Cruz公司）。主要仪器：江湾Ⅰ型脑立体定向仪（第二军医大学生产），磁共振仪（Advantage 1.5 Tesla GE Medical Systems，GE Corporation，USA)。实验动物：二级雄性SD大鼠，体重200～300g，共40只，由北京生物制品检定所繁育场提供，其特征已经鉴定。
1.2 实验方法
1.2.1 C6鼠脑胶质瘤模型的建立［1］ C6鼠胶质瘤细胞于含10%小牛血清的DMEM培养液中单层培养。接种细胞量为1.0×106/(10μl·只)。大鼠经10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于江湾Ⅰ型脑立体定向仪上，手术暴露颅骨标志，在前囟位置，矢状缝右侧3.0～3.5mm处用牙钻钻孔，孔径1.2mm，用微量注射器垂直穿刺右尾状核，将细胞悬液缓慢注入。
1.2.2 实验动物分组及组织标本采集 颅内实验运动分为4组，每组各10只SD大鼠：（1）对照组：接种野生型C6鼠胶质瘤细胞；（2）空载缓释剂组：接种野生型C6鼠胶质瘤细胞后瘤体多点注射半流状医用明胶；（3）ACTD治疗组：治疗组C6鼠胶质瘤细胞种植后第5天，MRI证实有肿瘤形成时，分别于第6、28天按上述方法麻醉、固定动物；同时将制备好的ACTD抗瘤缓释剂原位多点注入瘤体；（4）VM-26治疗组：治疗组C6鼠胶质瘤细胞种植后第5天，MRI证实有肿瘤形成时，分别于第6天按上述方法麻醉、固定动物；同时将制备好的VM-26抗瘤缓释剂载体原位多点注射入瘤体。接种后28、58天各处死1只，瘤标本做常规HE染色并检测凋亡；其余8只长期观察生存期。
各组实验动物在其自然死亡或人为处死后取出脑组织，将肿瘤标本于10%福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋后冠状切片，行大体标本观察、常规HE染色；另进行PCNA免疫组化染色。另一部分标本用OCT包埋液氮速冻-70℃保存冰冻切片，行原位细胞凋亡的检测。
1.2.3 MRI成像及检测方法［2］ 用GE公司1.5T Signa MR机成像，冠状面和矢状面T1WI平扫及增强扫描。根据动物模型对照组生存期规律，本实验的治疗组和空载组各10只大鼠于种植后5天进行全部检测，了解成瘤情况，以便治疗。大鼠种植后1周随机选择4只动物进行检测。以后连续检测各组大鼠的肿瘤生长变化，具体时间为2周、4周、8周、12周。每次检测，除至少选择3只种植后5天或1周已进行检测的动物连续监测外，其他动物则每次选择1～2只轮换进行检测，了解动物成瘤率。
肿瘤体积计算：在实验设计要求的时间点，根据强化影像在冠状扫描最大肿瘤平面测量肿瘤最大长径（L）及宽径（W），在矢状扫描最大肿瘤平面测量高径（H），代入公式：V=（4/3×π× L×Ｗ×Ｈ)×1/8。
1.2.4 组织标本的常规HE染色及细胞凋亡的检测 详见参考文献［1～3］，方法从略。
2 结果
2.1 大鼠一般情况与生存期观察 对照组及空载组：接种C6细胞1周后，大鼠觅食饮水活动明显减少，体重下降，继而出现进行性左侧偏瘫，并均于2～3周内死亡。8只大鼠平均生存期为（19.3±4.9)天。
2.2 治疗组 最初2～3周内大鼠一般情况类似对照组，处于濒死状态。ACTD组10只大鼠中3只分别于接种第16、21、37天死亡；另6只未死亡的大鼠自第4周起觅食饮水活动逐渐恢复正常，体重增加，其中2只分别于接种后第28、58天处死，3只于第200天处死行病理学检查。VM-26治疗组10只大鼠中5只分别于接种后第16、18、22、36、41天死亡；另5只未死亡的大鼠自第4周起觅食饮水活动逐渐恢复正常，体重增加，其中2只分别于接种后第28、58天处死，3只第200天处死行病理学检查。
2.3 MRI影像学及相应组织病理学变化 对4组大鼠定期检查MRI，并于检查后随机处死，观察相应病理变化。
2.3.1 对照组 接种C6细胞1周后瘤区表现为淡长T1长T2信号，轻度均匀或不均匀强化，中线结构轻度移位，病灶体积分别为155、150、186、172mm3。2周后瘤灶为长T1长T2信号，均匀强化或环状强化，中线结构
