1.3 观察指标与方法
1.3.1 细胞类型鉴定 细胞角蛋白（cytokeratin）广泛存在于人类上皮组织及培养的上皮细胞内，而波形蛋白（vimentin）则主要位于间质细胞中［5］。所以分别选择鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体作为第一抗体，以SP染色法进行染色，对分离获得的子宫内膜两种细胞进行鉴定。
1.3.2 光学显微镜观察 将无菌盖玻片放入六孔培养板中，消化分离后的间质细胞接种于六孔培养板盖玻片上，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养。从培养皿中取出间质细胞生长良好的载玻片，用PBS液洗去原培养液。消化分离后的腺上皮细胞予以常规涂片。间质细胞和腺上皮细胞用95%乙醇固定，常规HE染色，光学显微镜下观察。
1.3.3 细胞超微结构观察 将消化分离的正常对照子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞，EM在位和异位间质细胞及腺上皮细胞分别用2.5%戊二醛和1%锇酸双固定，618环氧树脂包埋，LKBⅤ型超薄切片机切片，醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，在ECNAI12型透视电镜下进行观察并摄像。
2 结果
2.1 原代细胞分离培养情况 分离培养的12份正常对照（子宫肌瘤）子宫内膜标本，成功11例，分离培养成功率为91.67%；分离培养的16份EM在位子宫内膜标本，成功15例，分离培养成功率为93.75%；分离培养的16份EM异位子宫内膜标本，成功12例，分离培养成功率为75.00%。
2.2 细胞类型鉴定结果 腺上皮细胞角蛋白染色大多数呈阳性反应，细胞纯度达85%；间质细胞波形蛋白染色呈阳性反应，细胞纯度达80%，经1次传代后，纯度可达85%以上。见图1。
2.3 细胞形态学观察结果
2.3.1 光学显微镜观察 （1）腺上皮细胞：正常对照、EM在位和异位子宫内膜腺上皮细胞均呈团状排列生长，为致密细胞集落，细胞呈多角形或蝌蚪形，边界清楚，排列紧密，胞浆饱满，核圆大。（2）间质细胞：EM在位和异位子宫内膜间质细胞接种24 h后基本都能贴壁。正常对照子宫内膜间质细胞与EM在位子宫内膜间质细胞体积均较大，呈多角形或梭形排列，胞浆薄而透明，核椭圆。细胞融合后类似成纤维细胞，贴壁后呈旋涡状生长。EM异位子宫内膜间质细胞形态较在位间质细胞小，分散生长，呈伸展、挺直状，中间稍宽，两头尖，似纺锤状。见图2。
图1 EM异位子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞形态鉴定（SP染色, ×300）（略）
Figure 1 Morphological identification of human endometriotic stromal and glandular cells (SP staining, ×300)
A: Endometriotic stromal cells; B: Endometriotic glandular cells.
A: Eutopic endometrial glandular cells from endometriosisfree women; B: Eutopic endometrial stromal cells from endometriosisfree women; C: Eutopic endometrial glandular cells from patients with endometriosis; D: Eutopic endometrial stromal cells from patients with endometriosis; E: Endometriotic glandular cells; F: Endometriotic stromal cells.
图2 正常对照和EM在位、异位子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞形态特征（HE染色, ×300）（略）
Figure 2 Morphological characterization of glandular and stromal cells from patients with endometriosis and endometriosisfree women (HE staining, ×300)
2.3.2 电子显微镜观察 （1）正常对照子宫内膜腺上皮细胞：细胞膜表面可见微绒毛，部分细胞膜表面有长绒毛，细胞间见紧密连接及桥粒连接，胞浆线粒体、核糖体、内质网较丰富，可见脂滴，核大，核仁明显。（2）正常对照子宫内膜间质细胞：一种是呈多角形的子宫内膜间质细胞，具有上皮样形态的细胞表面未见微绒毛，细胞间无连接结构，胞浆有散在核糖体及粗面内质网，可见溶酶体及一些囊泡，核膜平滑，核染色质均匀。另一种细胞呈梭形，电镜下见细胞无微绒毛，无连接结构，胞浆粗面内质网、核糖体和空泡较多，外周胞浆中有丰富的微丝。（3）EM在位子宫内膜腺上皮细胞：细胞成团，有极性，圆形，胞膜表面有微绒毛，核大，呈椭圆形或有切迹，细胞间见桥粒连接，胞浆线粒体、核糖体、粗面内质网较丰富，可见脂滴，核仁明显。（4）EM在位子宫内膜间质细胞：电镜下见细胞表面无微绒毛，无连接结构，胞浆内有线粒体，粗面内质网、核糖体和空泡较多，溶酶体多见，核大，有不规则切迹、凹陷，核内染色体稀疏，核仁明显。（5）EM异位子宫内膜腺上皮细胞：细胞游离，呈椭圆形，表面有细小微绒毛，细胞间有桥粒连接及紧密连接，核圆大，异染色质多，胞浆内多粗面内质网、核糖体、溶酶体及空泡。（6）EM异位子宫内膜间质细胞：呈长梭形细胞，有较多微绒毛和胞浆突起，核大，椭圆形，核仁明显，细胞间少有桥粒连接，胞浆内有不规则线粒体和空泡，粗面内质网、核糖体可见。见图3。
图3 正常对照和EM在位、异位子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞形态的电镜观察（略）
Figure 3 Morphological characterization of glandular and stromal cells from patients with endometriosis
and endometriosisfree women by electron microscope
A: Eutopic endometrial glandular cells from endometriosisfree women (×11 000); B: Eutopic endometrial stromal cells from endometriosisfree women (×9 300); C: Eutopic endometrial glandular cells from patients with endometriosis (×11 000); D: Eutopic endometrial stromal cells from patients with endometriosis (×11 000); E: Endometriotic glandular cells (×13 000); F: Endometriotic stromal cells (×6 300).
3 讨论
EM的病因至今仍不清楚，较为经典并被广泛接受的是经血逆流学说。随着腹腔镜的广泛应用，发现经血逆流在生育期妇女十分普遍，但发展为EM的则只是少数。目前主要有两种观点：一种认为EM与免疫缺陷有关，由于EM患者存在免疫缺陷，不能清除随经血逆流的“异位”子宫内膜细胞，而导致其在盆腔内种植［6,7］；另一种观点则提出EM的发生与EM患者在位子宫内膜细胞的特性有关，由于其发生了某些类似肿瘤细胞样的改变，使之逃脱了免疫监视和清除而得以在盆腔内种植［8］。有学者提出子宫内膜干细胞假说，即随经血逆流的具有分化潜能和自我更新特征的子宫内膜干细胞促使了最初异位病灶的产生，并维持病灶的存在，促使病灶的进一步发展［9］。无论何种学说，显然EM在位、异位子宫内膜细胞与正常生育期妇女在位子宫内膜细胞在基因、蛋白表达及生物学行为等方面均存在差异。因此，原代培养正常对照在位子宫内膜细胞和EM在位及异位子宫内膜细胞，对于研究细胞的生长、分化和代谢以及卵巢激素的作用机制，揭示EM的发病机制及临床治疗均具有重要意义。
但是，目前在位和异位子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞的分离培养成功率并不高，尤其是异位子宫内膜细胞的培养成功率较低。本研究采用自行改良方法对正常对照子宫内膜和EM在位和异位子宫内膜中腺上皮细胞及间质细胞进行了体外原代培养，分别获得纯度较高的腺上皮细胞和间质细胞，正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.67%；EM在位子宫内膜细胞分离培养成功率达93.75%；EM异位子宫内膜细胞分离培养成功率达75.00%，高于Ryan等［10］报道的56%和赫敏等［11］报道的68.1%。
EM异位子宫内膜体外培
