核酶在基因治疗中的研究进展(2)
作者:佚名; 更新时间:2014-12-13
到腺病毒载体,采用T7噬菌体启动子,实验结果显示此两种酶大大降低HPV-16E6/E7基因的表达。
3 核酶在抗肝炎病毒中的研究进展
我国是肝炎病毒感染的高发区,一直以来肝炎的治疗是临床医生颇为关注的问题。Birikh等[13]用一条合成的寡脱氧核苷酸链而来的三个核酶同时进行实验发现,HBVRNA可被核酶介导切割,从同一DNA模板转录的3条核酶可同时发挥作用,多核酶的表达将有益于对抗高的病毒目标序列变异。Aoki等[14]设计合成了针对HBVayw株P基因5′端2360位点的RCP,其作用底物为HBVaywP基因的翻译起始区(2140~2422区段),并将该核酶基因克隆到表达载体pSVL上,利用脂质体介导的DNA转染技术,将该核酶的基因引入到HepG2215细胞中(HepG2215细胞系由头尾相接的HBV对拷贝基因组转染肝癌细胞系HepG而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系)。实验证明,针对P基因5′端的核酶RCP对HbeAg和HbcAg的表达有一定程度抑制作用。Phylactou等首次使用发夹式核酶,作为抗HCV感染的有效治疗物质,阻碍病毒基因组的复制,保护细胞免受HCV感染,其设计合成的核酶针对5′-非翻译区(5-UTR)及编码衣壳蛋白的区域,实验表明针对编码HCV衣壳蛋白区域的核酶成为有希望抗HCV感染的一种治疗途径。Leontis等[15]使用了5?-NCR翻译有关的虫荧光素酶报告基因系统作为敏感的定量研究方法,分别设计出针对核酸位点136-160,313-317,496-520,及对373-388的四种核酶,证实核酶1、4在无细胞环境中均有效。而2、4在细胞内有效。推测核酶1、3的目标位点可能为双链区,而核酶2、4目标位点可能为单链区。
Langon等[16]针对HDV设计合成特异性核酶,切割位点位于基因链RNA的688/689nt和反基因链RNA的903/904nt,其切割活性的最短序列为84nt,所设计的核酶为复杂的三维结构,通过对反基因链RNA核酶25个位置进行代偿突变和共突变的实验,发现有8对碱基在空间结构上发挥相互作用。HDV核酶的研究对肝炎疾病的基因治疗带来了希望。
4 核酶在抗白血病中的研究进展
bcr-abl融合基因编码的具有异常蛋白酪氨酸激酶活性的p210蛋白是导致慢粒细胞白血病(Chronic myoloid leukemia, CML)发生的主要原因。Daley等[17]对bcl-abc融合基因cDNA序列,在融合位点的上游第-296bp,-1bp及下游15bp处分别设计3个相邻的锤头状核酶基因及侧翼序列,用于核酶的相互连接。实验结果显示,以上3个核酶均可特异性结合于融合基因mRNA 相应位点,给多步基因重组后,3个单核酶按相应顺序定向克隆到pDES载体中,构建成功单核酶pDES-RZ1,双核酶pDES-RZ12及三核酶切割载体pDES-RZ123。三核酶的联合作用明显提高核酶切割效率,抑制了融合蛋白的激酶活性。在急性早幼粒白血病病人(Acute promyelocytic leukemia,APL FAB,M3)中,t(15,17)的重新排列产生了一个融合性的转录产物(Fusion transcript)PML/RARа,而PML/RARа的表达和白血病基因的复制及治疗药物全反式维甲酸的作用密切相关。Nason等[18]针对PML/RARаmRNA设计合成锤头状核酶APL1.1(51nt),将其克隆到pGEM4载体中,采用T7启动子,用ECORⅠ酶切,在NB4APL细胞中表达,培养周期6天,剪切过程中核酶5′端和3′端自动释放,试验结果显示PML/RARа蛋白在该细胞中表达明显降低。
5 核酶在抗移植排斥反应的研究进展
同种异型骨髓移植常易发生移植排斥反应,长期以来是临床医生最焦虑的问题,用啮齿类动物建立模型研究穿孔素(Perforin)和FAS配体(FAS L),此为两种独立的裂解途径组成成分,大量实验显示这两种成分诱导了移植排斥反应。Du等[19]设计两种锤头状核酶在CTLL-2细胞中高效切割靶RNA的穿孔素和FAS配体,在tRNA诱导的RNA多聚酶Ⅲ启动子表达这两种核酶,将其插入来源于乳头瘤病毒多拷贝质粒,构建嵌合型有特异性二级结构的抗穿孔素和抗FASLtRNA核酶,此二级结构能使核酶易从tRNA功能域中分离出来。实验结果分析表明成功构建的核酶在CELL-2细胞中使穿孔素和FAS配体基因表达明显降低。
综上所述,近几年来随着对核酶研究的深入,为人类在基因治疗的道路上带来了曙光。由于其可以无法恢复地使靶基因失活,可在体外循环使用,并且其催化效率较反义寡核苷酸明显提高等独特优势而受到科研工作者的关注。10年来在治疗研究领域中所取得的重大进展都表明核酶在临床疾病的治疗中具有极大的潜在应用前景。但是核酶技术尚未完善,靶位点的最佳选择、载体的选择、导入体内的稳定性、切割效率,这些因素都阻碍着核酶在临床疾病基因治疗上的实施。近来,伴随着多位点核酶的设计并将其串联组成多功能核酶提高切割效率,运用逆转录载体技术的提高,对核酶进行化学修饰,及阳离子脂质体导入技术的发展都给核酶技术的研究带来更大的希望。不久的将来,核酶会成为一种极有前途的抗病药物,其特异性、高效性将在人类基因治疗领域中取得一定成果。
参考文献:
[1]Burke JM,Schmit T,Makedy K, et al.In vivo,high-resolution analysis of yeast and mammalian RNA-protein interactions[J].Biochem Soc Trans,1996,24(1);608-612.
[2]Amer MK,Elad H.RNA splicing and ribozyme cleavage by use of terminal transferase-dependent PCR[J].Human Gene Therapy,1998,9(2);587-595.
[3]Weerasinghe M,Chank SG,Lank B,et al.The p5abc peripheral element facilitates preorganization of the tetrahymena group I ribozyme for catalysis[J].J Virol,1991,65(2):5531-5536.
[4]Phylactou LA, Cowan KN,Gaohk G,et al.Retrovirally expressed anti-HIV ribozymes confer a selective survival advantage on CD4+ T cells in vitro[J].Biophys Acta,1998,1372(3):55-60.
[5]Westaway SK,Ghuty D,Boot K,et al.Characterization of the azoarcus ribozyme:tight binding to guanosine and substrate by an unusually small group I ribozyme[J].Antisense Nucleic Acid Drug Dev,1998,9(2):621-627.
[6]Wang L,Raid F.Alessandro M,Takacla G,et al.The role of the cleavage site 2’-hydroxyl in the tetrahymena group I ribozyme reaction[J].Human Gene Therapy,1998,9(3):1283-1286.
[7]Konopka K,Koizumi M,Schmaid G,et al.Fast folding of a ribozyme by stabilizing core interactions:evidence for multiple folding pathways in RNA[J].Biochem Biophys Acta,1998,1372(2):55-60.
[8]Alessandro M,Alvarez LM,Baid H,et al.Induction of apoptosis in oral cancer cells by an anti-bcl-2 ribozyme delivered by an adenovirus vector[J].Human Gene Therapy,1998,9(4):621-629.
[9]Koizumi M,Chen Z,Gouhay K,et al.Effects of C5 protein on Echerichia coli RNase P catalysis with a precursor tRNA(Phe) bearing a single mismatch in the acceptor stem[J].Nueleoside Nucleotides,1998,3(3):1189-1194.
[10]Alvarez LM,Birikh KR.In vivo inhibition by a site-specific catalytic RNA subunit of RNase P designed against the BCR-ABL oncogenic products:a novel approach for cancer treatment[J].Pro Natl Alad Sci,1998,3(3):1189-1196.
[11]Chen Z,Aoki Y,Gao YG,et al.A mutation-independent therap.The structural basis for molecular recognition by the vitamin B12 RNA aptamer[J].Cancer Gene Therapy,1996,3(2):18-27.
[12]Lu D,Phylanctou LA,Franch T,et al.Intracellular mRNA cleavage induced through activation of RNase P by nuclease-resistant external guide sequences[J].Cancer Gene Ther,1994,9(3):267-272.
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3 核酶在抗肝炎病毒中的研究进展
我国是肝炎病毒感染的高发区,一直以来肝炎的治疗是临床医生颇为关注的问题。Birikh等[13]用一条合成的寡脱氧核苷酸链而来的三个核酶同时进行实验发现,HBVRNA可被核酶介导切割,从同一DNA模板转录的3条核酶可同时发挥作用,多核酶的表达将有益于对抗高的病毒目标序列变异。Aoki等[14]设计合成了针对HBVayw株P基因5′端2360位点的RCP,其作用底物为HBVaywP基因的翻译起始区(2140~2422区段),并将该核酶基因克隆到表达载体pSVL上,利用脂质体介导的DNA转染技术,将该核酶的基因引入到HepG2215细胞中(HepG2215细胞系由头尾相接的HBV对拷贝基因组转染肝癌细胞系HepG而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系)。实验证明,针对P基因5′端的核酶RCP对HbeAg和HbcAg的表达有一定程度抑制作用。Phylactou等首次使用发夹式核酶,作为抗HCV感染的有效治疗物质,阻碍病毒基因组的复制,保护细胞免受HCV感染,其设计合成的核酶针对5′-非翻译区(5-UTR)及编码衣壳蛋白的区域,实验表明针对编码HCV衣壳蛋白区域的核酶成为有希望抗HCV感染的一种治疗途径。Leontis等[15]使用了5?-NCR翻译有关的虫荧光素酶报告基因系统作为敏感的定量研究方法,分别设计出针对核酸位点136-160,313-317,496-520,及对373-388的四种核酶,证实核酶1、4在无细胞环境中均有效。而2、4在细胞内有效。推测核酶1、3的目标位点可能为双链区,而核酶2、4目标位点可能为单链区。
Langon等[16]针对HDV设计合成特异性核酶,切割位点位于基因链RNA的688/689nt和反基因链RNA的903/904nt,其切割活性的最短序列为84nt,所设计的核酶为复杂的三维结构,通过对反基因链RNA核酶25个位置进行代偿突变和共突变的实验,发现有8对碱基在空间结构上发挥相互作用。HDV核酶的研究对肝炎疾病的基因治疗带来了希望。
4 核酶在抗白血病中的研究进展
bcr-abl融合基因编码的具有异常蛋白酪氨酸激酶活性的p210蛋白是导致慢粒细胞白血病(Chronic myoloid leukemia, CML)发生的主要原因。Daley等[17]对bcl-abc融合基因cDNA序列,在融合位点的上游第-296bp,-1bp及下游15bp处分别设计3个相邻的锤头状核酶基因及侧翼序列,用于核酶的相互连接。实验结果显示,以上3个核酶均可特异性结合于融合基因mRNA 相应位点,给多步基因重组后,3个单核酶按相应顺序定向克隆到pDES载体中,构建成功单核酶pDES-RZ1,双核酶pDES-RZ12及三核酶切割载体pDES-RZ123。三核酶的联合作用明显提高核酶切割效率,抑制了融合蛋白的激酶活性。在急性早幼粒白血病病人(Acute promyelocytic leukemia,APL FAB,M3)中,t(15,17)的重新排列产生了一个融合性的转录产物(Fusion transcript)PML/RARа,而PML/RARа的表达和白血病基因的复制及治疗药物全反式维甲酸的作用密切相关。Nason等[18]针对PML/RARаmRNA设计合成锤头状核酶APL1.1(51nt),将其克隆到pGEM4载体中,采用T7启动子,用ECORⅠ酶切,在NB4APL细胞中表达,培养周期6天,剪切过程中核酶5′端和3′端自动释放,试验结果显示PML/RARа蛋白在该细胞中表达明显降低。
5 核酶在抗移植排斥反应的研究进展
同种异型骨髓移植常易发生移植排斥反应,长期以来是临床医生最焦虑的问题,用啮齿类动物建立模型研究穿孔素(Perforin)和FAS配体(FAS L),此为两种独立的裂解途径组成成分,大量实验显示这两种成分诱导了移植排斥反应。Du等[19]设计两种锤头状核酶在CTLL-2细胞中高效切割靶RNA的穿孔素和FAS配体,在tRNA诱导的RNA多聚酶Ⅲ启动子表达这两种核酶,将其插入来源于乳头瘤病毒多拷贝质粒,构建嵌合型有特异性二级结构的抗穿孔素和抗FASLtRNA核酶,此二级结构能使核酶易从tRNA功能域中分离出来。实验结果分析表明成功构建的核酶在CELL-2细胞中使穿孔素和FAS配体基因表达明显降低。
综上所述,近几年来随着对核酶研究的深入,为人类在基因治疗的道路上带来了曙光。由于其可以无法恢复地使靶基因失活,可在体外循环使用,并且其催化效率较反义寡核苷酸明显提高等独特优势而受到科研工作者的关注。10年来在治疗研究领域中所取得的重大进展都表明核酶在临床疾病的治疗中具有极大的潜在应用前景。但是核酶技术尚未完善,靶位点的最佳选择、载体的选择、导入体内的稳定性、切割效率,这些因素都阻碍着核酶在临床疾病基因治疗上的实施。近来,伴随着多位点核酶的设计并将其串联组成多功能核酶提高切割效率,运用逆转录载体技术的提高,对核酶进行化学修饰,及阳离子脂质体导入技术的发展都给核酶技术的研究带来更大的希望。不久的将来,核酶会成为一种极有前途的抗病药物,其特异性、高效性将在人类基因治疗领域中取得一定成果。
参考文献:
[1]Burke JM,Schmit T,Makedy K, et al.In vivo,high-resolution analysis of yeast and mammalian RNA-protein interactions[J].Biochem Soc Trans,1996,24(1);608-612.
[2]Amer MK,Elad H.RNA splicing and ribozyme cleavage by use of terminal transferase-dependent PCR[J].Human Gene Therapy,1998,9(2);587-595.
[3]Weerasinghe M,Chank SG,Lank B,et al.The p5abc peripheral element facilitates preorganization of the tetrahymena group I ribozyme for catalysis[J].J Virol,1991,65(2):5531-5536.
[4]Phylactou LA, Cowan KN,Gaohk G,et al.Retrovirally expressed anti-HIV ribozymes confer a selective survival advantage on CD4+ T cells in vitro[J].Biophys Acta,1998,1372(3):55-60.
[5]Westaway SK,Ghuty D,Boot K,et al.Characterization of the azoarcus ribozyme:tight binding to guanosine and substrate by an unusually small group I ribozyme[J].Antisense Nucleic Acid Drug Dev,1998,9(2):621-627.
[6]Wang L,Raid F.Alessandro M,Takacla G,et al.The role of the cleavage site 2’-hydroxyl in the tetrahymena group I ribozyme reaction[J].Human Gene Therapy,1998,9(3):1283-1286.
[7]Konopka K,Koizumi M,Schmaid G,et al.Fast folding of a ribozyme by stabilizing core interactions:evidence for multiple folding pathways in RNA[J].Biochem Biophys Acta,1998,1372(2):55-60.
[8]Alessandro M,Alvarez LM,Baid H,et al.Induction of apoptosis in oral cancer cells by an anti-bcl-2 ribozyme delivered by an adenovirus vector[J].Human Gene Therapy,1998,9(4):621-629.
[9]Koizumi M,Chen Z,Gouhay K,et al.Effects of C5 protein on Echerichia coli RNase P catalysis with a precursor tRNA(Phe) bearing a single mismatch in the acceptor stem[J].Nueleoside Nucleotides,1998,3(3):1189-1194.
[10]Alvarez LM,Birikh KR.In vivo inhibition by a site-specific catalytic RNA subunit of RNase P designed against the BCR-ABL oncogenic products:a novel approach for cancer treatment[J].Pro Natl Alad Sci,1998,3(3):1189-1196.
[11]Chen Z,Aoki Y,Gao YG,et al.A mutation-independent therap.The structural basis for molecular recognition by the vitamin B12 RNA aptamer[J].Cancer Gene Therapy,1996,3(2):18-27.
[12]Lu D,Phylanctou LA,Franch T,et al.Intracellular mRNA cleavage induced through activation of RNase P by nuclease-resistant external guide sequences[J].Cancer Gene Ther,1994,9(3):267-272.
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