作者：伊正君，朱道银，杨春，李俊明，何永林，陈全

【关键词】  靶向

    comConstruction and identification of a Mycobacterium smegmatis strain to targetedly deliver eukaryotic coexpression plasmid encoding human granulysin and murine single chain IL12

       【Abstract】 AIM: To construct a recombinant Mycobacterium smegmatis strain that can targetedly deliver the eukaryotic coexpression plasmid pZM03 encoding human granulysin (GLS) and murine single chain IL12 into macrophages. METHODS:  Coding sequences of human granulysin, murine single chain IL12 and OriM were simultaneously cloned into pBudCE4.1, which had multiple promoters to form the shuttle plasmid pBudCE4.1/GLS/IL12/OriM (simply named pZM03). The shuttle plasmid was transformed into mc2155 and identified from the recombinants by PCR. The targeting property of the recombinant was detected by coincubating the strains with murine macrophage RAW264.7. RESULTS:  The new recombinant strain that could targetedly deliver pZM03 into macrophages was successfully constructed. CONCLUSION:  It is feasible to targetedly deliver eukaryotic expression plasmids into macrophages by using Mycobacterium smegmatis as an attenuated biological vector.

    【Keywords】 granulysin; interleukin 12; Mycobacterium smegmatis; shuttle plasmid; macrophage

    【摘要】 目的:构建携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠单链IL12基因的真核共表达载体pZM03，并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗. 方法:将人GLS，小鼠单链IL12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中，得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2155，通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒；通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性. 结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌. 结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.

    【关键词】 颗粒溶素；白细胞介素12；耻垢分枝杆菌；穿梭质粒；巨噬细胞

    0引言

    结核病位居单一病原引起死亡的严重传染病之首［1］. 在结核病的感染、发病与治疗过程中，宿主本身的免疫素质和免疫状态是决定预后转归的重要因素［2］. 其中巨噬细胞既是重要的抗原呈递细胞，也是参与形成潜伏感染的关键环节. 本研究目的旨在构建一种携带人天然颗粒溶素（granulysin，GLS）和小鼠单链IL12基因的真核共表达载体pZM03、并可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗. 为明确该重组疫苗的靶向递送和目标基因在巨噬细胞内的转录和表达效果，信捷职称论文写作发表网，我们首先在细胞水平上进行了初步探索.

    1材料和方法

    1.1材料携带人GLS基因的质粒pGLS738由本实验室构建；携带小鼠单链IL12基因的质粒pSFGmIL12由Graham J.Liechke博士惠赠，其中p40，p35两亚单位基因由一45 bp的Linker连接，其编码产物的生物学活性已在活体内证明；含有分枝杆菌复制子OriM的质粒pMV261及耻垢分枝杆菌mc2155由Torin博士［3］惠赠；多启动子真核共表达载体pBudCE4.1购自Invitrogen公司；质粒pUC118购自大连宝生物公司；质粒pEGFPC1，E.coli Top10为本室保存；小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药理学教研室. 质粒DNA小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）、限制性核酸内切酶、高保真ProbestTaq酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均购自大连宝生物公司；Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德公司；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.

    1.2方法

    1.2.1pZM03质粒的构建根据GenBank（登录号：NM_006433）中人GLS的cDNA序列，设计引物P1，P2，分别含有BspEI，HindIII和BamHI酶切位点. P1的序列为 5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGGGCCGTGACTACAGGACCT3′; P2的序列为5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCACCTGAGGTCCTCACAGAT3′，引物由大连宝生物公司合成. 由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在引物设计中去除了GLS的分泌肽序列. 根据小鼠IL12 p40，p35两亚单位编码基因的序列设计P3，P4引物，分别含有EcoRI，NotI和HindIII，KpnI酶切位点. P3的序列为5′GAATTCGCGGCCGCATATGGGTCCTCAGAAGCTAAC3′; P4的序列为5′GATAAGCTTGGTACCGGATCCTCAGGCGGAGCTCAGAT3′. 引物由上海博亚生物公司合成. 根据pAL5000中OriM的编码序列设计P5，P6引物，分别含有BamHI，NheI和NheI，HindIII酶切位点. P5的序列为5′GGATCCGCTAGCTAAAGCCAGGTGAGCCCACCAGCTC3′; P6的序列为5′GCGAAGCTTGCTAGCGCACTACAACGGAGTTCGCCACGT3′.引物由上海博亚生物公司合成. pZM03质粒的构建路线见图1.

     图1pZM03真核共表达质粒的构建程序

    1.2.2重组质粒的细胞转染及表达小鼠巨噬细胞株RAW264.7以含100 mL/L小牛血清RPMI 1640培养液，置24孔板内，以37℃, 50 mL/L CO2培养，按转染试剂盒说明书用重组pZM03质粒和空质粒pBudCE4.1分别转染RAW264.7细胞. 转染48 h后分别收集实验孔及对照孔的细胞做:①以RTPCR法对两种目的基因的mRNA进行检测：抽提细胞总RNA进行逆转录，以各自的cDNA为模板，分别以P1和P2， P3和P4为引物，作PCR扩增；②GLS表达产物的检测：取出培养孔内细胞爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法按照试剂盒说明进行.

    1.2.3重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建及其靶向性检测将对数生长期的mc2155菌株以预冷的100 mL/L甘油在4℃低温洗涤3次［4］，取90 μL感受态细菌加入10 μL纯化的pZM03质粒，轻轻混匀，冰浴10 min，转入预冷的1 mm电转杯中，2500 V，4 ms电击一次，迅速加入0.8 mL完全7H9培养基，37℃孵育3 h后涂布到含Zeocin 40 mg/L的7H10固体平板上，37℃孵育72 h后挑取阳性菌落增菌后抽提质粒，同时取1 mL菌液，离心弃上清，沉淀加入0.5 mL三蒸水，100℃热裂解8 min，取上清2 μL或质粒抽提物1 μL为模板，分别作GLS，IL12和OriM的PCR扩增. 以鉴定正确的重组菌1×1011 cfu/L感染培养的RAW264.7细胞，12 h后取出培养孔内的细胞爬片进行抗酸染色并观察. 同时将鉴定正确的重组菌划线传代5～10代后再次以PCR法进行鉴定，以观察重组质粒的稳定性.

    2结果

    2.1pZM03质粒在小鼠RAW264.7细胞中的转录与表达在转染有pZM03质粒的RAW264.7细胞中同时扩增出了编码人GLS和小鼠单链IL12的cDNA片段（图2）. 图中第1，4泳道分别为约267 bp的GLS片段和约1671 bp的IL12片段，与理论预计值图2pZM03真核共表达质粒转染RAW264.7细胞后转录产物的RTPCR结果完全相符. 用山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗,对pZM03质粒转染的小鼠RAW264.7细胞作免疫酶染色，发现在细胞质中有强阳性染色颗粒（图3）.A:用pZM03质粒转染后的RAW264.7细胞;     B: 用pBudCE4.1质粒转染后的阴性对照.
图3pZM03质粒转染RAW264.7细胞48 h后颗粒溶素的表达×250

    2.2重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建及其靶向性检测以重组菌裂解物或质粒抽提物为模板，作GLS，IL12和OriM的PCR扩增（图4）. 图中第1，2和3泳道分别为约267 bp的GLS片段、约1671 b