图5感染12 h后RAW264.7细胞中重组分枝杆菌的富集×1000
3讨论
细胞免疫是宿主抗结核感染的主要保护机制，活动性结核病患者全身整体免疫状态倾向于Th2型［5-6］. IL12是一种功能强大的Th1型免疫反应诱导剂，外源给予IL12可产生Th2免疫状态向Th1型免疫状态的逆转. 在一个已建立Th2型免疫反应的感染动物中，外源给予IL12仍能诱导出一个独立的与新免疫原相关的Th1型免疫反应，Pollock等［7］发现能够促进Th2反应和强烈IgE反应的CPB2.8抗原当与IL12共同免疫小鼠时，依旧能够引发出Th1型反应并与一定程度上的保护作用有关. 将共表达小鼠单链IL12与分枝杆菌保护性抗原Ag85B的真核质粒免疫小鼠，通过细胞因子本身的生物学活性及其佐剂作用可以优化宿主抗结核的特异性免疫反应，诱导机体产生更加有效的免疫保护作用［8］. 同时IL12对维持一定数量的Th1记忆细胞也是必需的［9］，但IL12只能通过刺激免疫系统间接发挥治疗作用，不能对巨噬细胞内的Mtb产生直接的杀伤作用.研究发现短尾猿用BCG第二次接种免疫后可激发2到9倍于初免时的Vγ2Vδ2+ T细胞扩增，这是由于激活了初免时的记忆性T细胞，产生的回忆性反应引起的，并且这种扩增可持续7 mo之久，其扩增强度与保护短尾猿免受致死性Mtb攻击有正相关［10］；另有学者利用来自PPD反应阳性健康者的外周血单个核细胞，研究了受抗原刺激后扩增的T细胞抑制巨噬细胞内分枝杆菌生长的作用，发现BCG活菌苗和Mtb全细菌裂解液刺激的记忆性T细胞能显著抑制分枝杆菌的胞内生长，而休眠T细胞缺乏此抑制能力，这表明休眠T细胞需要特定的抗原刺激来激活.耻垢分枝杆菌是人体的正常菌群，使用重组耻垢分枝杆菌菌苗，一方面可作为新型减毒有机体载体向巨噬细胞靶向递送GLS/IL12真核共表达质粒，另一方面还可对已经感染结核杆菌的机体进行二次免疫激发，以对结核病进行交叉基因治疗和免疫治疗（同时还可以结合药物治疗）的综合治疗. 其原理是利用耻垢分枝杆菌菌体抗原与IL12共同作用于结核感染的机体后，通过分枝杆菌属共同抗原促进并激发宿主针对结核杆菌的特异性细胞免疫，纠正机体的免疫状态，间接清除体内的结核杆菌；与此同时耻垢分枝杆菌还可以作为基因治疗的减毒生物体载体，将含有激活的细胞毒性T淋巴细胞分泌的GLS基因的真核共表达质粒pZM03靶向导入巨噬细胞中表达，通过GLS与传统药物完全不同的机制直接杀灭胞内潜伏的结核杆菌，从而阻断结核杆菌在巨噬细胞内的潜伏.我们将编码人GLS的DNA片段和小鼠单链IL12基因、分枝杆菌复制子OriM同时克隆入pBudCE4.1后，构建了可在分枝杆菌中复制，同时又可以在真核细胞中进行共表达的穿梭质粒pZM03，并转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，在体外从细胞水平同时检测到了两种基因的转录与表达产物，一方面表明在小鼠来源的巨噬细胞中同时获得此两种功能基因的表达是可能的，另一方面也证明利用分枝杆菌作为生物体载体靶向递送治疗性基因是可能的. 这为后续在活体动物模型中应用该方法研究GLS，IL12及耻垢分枝杆菌的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础.
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