【摘要】 目的 观察分次照射对三种体外培养的来源于人体不同组织的具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞系细胞存活分数的影响，考察它们的亚致死损伤修复的情况。方法 以三种体外培养的来源于人体不同组织的具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞为实验对象，单次及分次接受60Coγ射线0～6Gy内不同剂量点照射。以克隆形成率作为标准检测细胞的存活率。结果 在0～6Gy的小剂量范围内，6h分次照射的细胞存活率明显高于单次照射。结论 在6h之内，三种组织来源的肿瘤细胞都存在亚致死损伤修复。这与理论相符合，同时也与这三种肿瘤细胞在临床上对放疗的高抗性表现一致。本实验可从细胞水平上为临床治疗这三种组织来源的肿瘤细胞的放疗方案的制定提供理论依据和参考。
【关键词】 亚致死损伤修复；肿瘤细胞；分次照射
The effect of fractional irradiation on malignant human tumor cells irradiated with γ-rays
【Abstract】 Objective To observe the high irradiation influence of the three kinds of malignant human tumor cell lines which derived from different tissues and had low radiosensitivity. Methods After irradiated with 60Co γ-rays， The survival fractions of single irradiation and fractional irradiation were studied by colony-formation assays. Result That the survival fractions of fractional irradiation were higher than that of single irradiation for all of the three kinds of cells and it indicated that in 6 hours all of the three kinds of cells had high repair ability to sublethal damage. Conclusion The result was consist with the theory and the low radiosensitivity of the three kinds of cells. This assay can be considered as reference data for clinical therapy.
【Key words】 sublethal damage repair；tumor cells；fractional irradiation
临床治疗肿瘤时，总是把剂量分成许多分次，使每个分次照射时受到的损伤有可能得到部分修复，从而对那些能积累和有效地修复损伤的细胞给予相应的保护，总治疗时间的延长让存活细胞能繁殖，并且对增殖快的组织有利。在细胞修复和再群体化之外，分次和延长时间还能有益于乏氧细胞的再氧合和导致处于细胞周期的细胞分布的改变，这些都影响照射最终的生物学效应［1］。
分次照射的生物效应依赖于剂量分布和时间以及分次的关系。临床把照射的次数叫作分次数（fractionation)，每分次的剂量叫作分次量(fractionation dose)，而第一次和最后一次之间的时间叫总疗程时间(overall time)。当分次数和总疗程时间增加时，生物效应降低，从而要得到一个特定效应的剂量(等效剂量，isoeffect dose)必须增加剂量。这些因素的重要性有赖于所照射的组织和加以考虑的效应表现。当两个组织受同样的照射时，分次情况和总疗程时间的不同可能导致不同的效应，这称之为一个组织生物效应的修饰。这个效应的差异在放射治疗中非常重要，因此，考察不同组织来源的肿瘤细胞接受分次照射的生物学效应，为临床制定出合理的分次照射方案有着重要的意义［1］。从细胞水平上分析，亚致死损伤(sublethal damage)是哺乳动物辐射损伤的一种重要类型，这时细胞内只有一部分关键靶点发生电离事件，只要给以足够时间，细胞有可能对这些损伤进行修复［2］。正是由于这种修复的存在，分次照射时细胞的存活率比一次照射时明显提高。亚致死损伤修复程度和存活曲线肩的宽度之间有很好的相关性，这是因为两者都是同一基本现象(亚致死损伤修复的累积)的表现［3，4］。有些哺乳动物细胞的存活曲线都有一个宽的肩，它的分割剂量实验提示有大量的亚致死损伤修复。别的类型的细胞的存活曲线有很小的肩，反映了有限的亚致死损伤修复。在用线性平方模式拟合的存活曲线中，是二次组分β造成曲线的弯曲和产生分割剂量的节制效应，即β组分反映亚致死损伤修复。大的肩相当于小的α/β比值。
本实验拟选取三种来源于人体不同组织的具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞系：人肝癌细胞SMMC-7721，黑色素瘤细胞A375和宫颈癌细胞HeLa，进行体外γ射线的单位及分次照射实验，观察分次照射对这三种体外培养的肿瘤细胞存活分数的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞及其培养 实验所用的人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌Hela细胞购自北京肿瘤研究所，人黑色素瘤A375细胞购自北京301医院，培养基为含10%胎牛血清(杭州四季青)的RPMI-1640(GIBCO)培养液，置于5%CO2培养箱中37℃培养。根据预实验绘制的生长曲线，细胞传代20h后处于对数生长期，选取此时的细胞进行照射。
1.2 辐射 用兰州医学院第一附属医院放射科的60Co源进行γ射线辐射。单次照射共设0Gy，0.5Gy，1Gy，1.5Gy，2Gy，3Gy'4Gy'6Gy八个剂量点，分次照射相应设0Gy+0Gy'0.5Gy+0.5Gy'1Gy+1Gy'1.5Gy+1.5Gy'2Gy+2Gy'3Gy+3Gy六个剂量点，分次照射时间间隔设为6h。每个剂量点设有3个平行样品。
1.3 照射后处理 照射后的细胞经胰蛋白酶消化后进行细胞精确计数。选择合适的稀释倍数稀释后，以约100个/皿的浓度种植于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中37℃培养7天。用1%甲基蓝进行染色，统计细胞数大于50个的克隆数。
1.4 实验数据获取 细胞存活分数(survival fraction'SF)按下列公式(1)计算：
SF(%)=(SX/S0)×100% (1)
(1)式中SX代表受照细胞克隆形成率，S0代表对照细胞克隆形成率。最后获取的SF值为三组平行样品的平均值±SD(standard diviation)。分别绘制三种细胞单次及分次照射的剂量-存活曲线，进行线性平方模型的拟合。
2 结果与讨论
2.1 A375细胞单次及分次照射的剂量-存活曲线 见图1。
图1 γ射线单次及分次照射A375细胞的剂量-存活曲线
2.2 SMMC-7721细胞单次及分次照射的剂量-存活曲线 见图2。
图2 γ射线单次及分次照射SMMC-7721细胞的剂量-存活曲线
2.3 HeLa细胞单次及分次照射的剂量-存活曲线 见图3。从图1、2、3可以看出，三种来源于不同组织的人肿瘤细胞在总剂量一定的情况下，分次照射的细胞存活分数均明显高于单次照射后的细胞存活分数，信捷职称论文写作发表网，我们分次照射的时间是6h，说明在6h之内，三种组织来源的肿瘤细胞都存在亚致死损伤修复。从理论上分析，由于三种细胞单次照射的剂量-存活曲线都存在明显的肩区，而亚致死损伤修复程度和存活曲线肩的宽度之间有很好的相关性，这是因为两者都是同一基本现象(亚致死损伤修复的累积)的表现，所以三种细胞都应该存在亚致死损伤修复，我们的实验结果与理论相符合，同时也与这三种肿瘤细胞在临床上对放疗的高抗性表现一致。
图3 γ射线单次及分次照射HeLa细胞的剂量-存活曲线
由于国内外大部分分次照射实验的数据都来源于临床活体实验，体外培养细胞的分次照射实验很少，本实验作为基础研究，考察了三种来源于不同组织的人肿瘤细胞的亚致死损伤修复的情况，可从细胞水平上为临床治疗这三种组织的肿瘤细胞的放疗方案的制定提供理论依据和参考。
【参考文献】
1 沈瑜，糜福顺.肿瘤放射生物学.北京：中国医药科技出版社，2002，133-142.
2 夏寿萱.放射生物学.北京：军事医学科学出版社，1998，59-61.
3 Weyrather WK'Ritter S'Scholz M'et al.RBE for Carbon Track-segment Irrad iation in Cell Lines of Differing Repair Capacity.Int J Radiat Blol'1999'75:1357-1364.
4 刘淑华，周继文，雷伦君，等.60Co γ射线一次和分次照射的生物效应.中国放射与防护医学杂志，1991，11(2)：96-99.
