作者：陈伟燕，张跃明，葛刚锋，刘岩
【摘要】 目的 探讨益气养阴活血法对糖尿病大鼠额叶皮质神经元神经营养因子3（NT-3）表达的影响。方法 用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱发糖尿病大鼠模型，益气养阴活血药灌胃给药进行防治，8周后取脑做NT-3免疫组化染色。结果 正常对照组大鼠额叶皮质内NT-3阳性神经元数目多，染色深；糖尿病模型组大鼠额叶皮质内NT-3阳性神经元数目少，染色浅；益气养阴活血法治疗组大鼠数目和染色与正常组大鼠接近。结论 益气养阴活血法具有防治糖尿病大鼠额叶皮质神经元退行性变的功效。
【关键词】 糖尿病 益气养阴活血法 额叶 神经营养因子3 大鼠
Effects of Yiqi Yangyin Huoxue principle on the expression of neurotrophin-3 of the frontal lobe cortex neurons in diabetic rat brain
【Abstract】 Objective To explore the effects of Yiqi Yangyin Huoxue principle on the expression of neurotrophin-3 of the frontal lobe cortex neurons in diabetic rat brain.Methods The diabetic rat model was produced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ).The Yiqi Yangyin Huoxue drugs was poured into the stomach of the treated group. The brains were taken and the expression of neurotrophin-3 were estimated with immunochemistry 8 weeks later.Results Immunochemistry showed that there were many positive cells in the frontal lobe cortex of the normal group and they were deeply dyed.Positive cells of the model group decreased and their color was shallow .The number and the color of positive cells in the treated group were close to that of the normal group.Conclusion The Yiqi Yangyin Huoxue principle can effectively improve the degeneration of the frontal lobe cortex neurons in diabetic rat brain.
【Key words】 diabetes Yiqi Yangyin Huoxue method frontal lobe neurotrophin-3 rat
糖尿病属中医消渴症的范畴，是一种严重危害人体健康的常见病、多发病。糖尿病已成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重的非传染性疾病，糖尿病晚期病人常伴脑神经元的退行性变。神经营养因子3（NT-3）广泛分布在中枢神经系统内，具有维持神经元存活、诱导其轴突生长和促进损伤神经元的修复及阻止神经元损伤后死亡的功能。本实验观察养阴活血法治疗后糖尿病大鼠额叶皮质神经元NT-3的表达的改变，探讨此中医药疗法能否防止糖尿病大鼠额叶皮质神经元的退变。
1 材料与方法
1.1 试验药物及试剂 益气养阴活血中药复方主要由黄芪30g，淮山药15g，葛根15g，枸杞子15g，丹参15g，红花12g，麦冬15g，马齿苋15g等组成，组成药物均购自浙江省中医院中药房，由浙江中医学院制剂室制备成含生药4g/ml，4℃冰箱保存备用。链脲佐菌素（STZ）和免疫组化试剂盒均为Sigma公司产品。
1.2 动物分组及模型复制 健康雄性SD大鼠30只，清洁级，体重：200～250g ，购自浙江大学医学院动物实验中心。适应性饲养1周后，将大鼠随机分三组：正常对照组、糖尿病模型组和益气养阴活血法治疗组，每组各10只，后两组大鼠空腹12h后腹腔注射pH4.4枸橼酸钠缓冲液配成的1.25% STZ，按50mg/kg剂量给药，正常对照组大鼠腹腔注射相同剂量的pH4.4枸橼酸钠缓冲液。3天后空腹血糖大于16.7mmol/L为糖尿病模型成功。益气养阴活血法治疗组每日灌服养阴活血降糖饮10ml/kg 1次，正常对照组和糖尿病模型组每日灌服相同剂量的生理盐水。
1.3 免疫组织化学染色 大鼠采用2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉后，立即开胸暴露心脏，经左心室插管，剪开右心房，快速灌注灭菌生理盐水300ml后，改灌注4%多聚甲醛500ml，断颈后打开颅腔完整取脑，浸入灭菌后的30%蔗糖PBS溶液过夜直到脑组织块下沉。取出脑组织块，冰冻切片机作连续切片，片厚20μm。按标准ABC免疫组化法操作，一抗为兔抗大鼠、小鼠等多克隆NT-3抗体（1：200），阴性对照组不加一抗，二抗为羊抗兔生物素化抗体（1：100）。
1.4 结果观察 每组动物各取8只，每只在相应的额叶部位连续切片，信捷职称论文写作发表网，每隔三张取一张，共取15张切片，按照包新民图谱的B-1.0至B-1.6平面中的Prcl区，在装有目镜网格测微尺(80μm×80μm) 400倍视野下计数每例切片10个网格的NT-3阳性细胞数，计算出每0.05mm2面积内的阳性神经元数目即阳性细胞密度。每张切片在相应部位在Olympus显微镜下拍照，用浙江大学医学院神经生物实验室开发的Static IMC 2.0 图像处理系统，测定每张切片随机选取的10个NT-3阳性细胞胞浆的算出每个阳性神经元的平均光密度，以反应染色深浅的程度。
1.5 统计学分析 本实验数据处理采用SPSS for Window 10.0统计软件。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组间显著性采用t检验。
2 结果
2.1 一般情况观察 糖尿病组大鼠反应明显迟钝，精神萎靡，多数时间趴着，毛色渐渐失去光泽，每天垫料要换数次、每次都湿透，体重也渐渐下降。治疗组大鼠反应较灵敏，毛色可，多尿、体重下降明显。正常对照组大鼠发应灵敏，警觉，好打斗，垫料换一次即可，体重增加。
2.2 各组大鼠额叶皮质NT-3免疫组化结果 正常对照组的Prcl区中的额叶皮质NT-3神经元数量多，染色深，锥体细胞顶树突明显，轮廓清楚；糖尿病组大鼠Prcl区中的额叶皮质NT-3神经元数量少（与正常组比较，P＜0.01），染色浅，锥体细胞顶树突不明显；治疗组大鼠与正常对照组接近。目镜网格法测得的各组大鼠额叶皮质在400倍显微镜下NT-3阳性细胞密度及用Static IMC 2.0 图像处理系统测得的每个NT-3阳性神经元的平均光密度见表1，各组大鼠额叶皮质神经元免疫组化结果见图1、2、3。
表1 各组大鼠额叶皮质阳性细胞密度及阳性细胞的平均光密度 （±s）
注：糖尿病模型组比较，△△P＜0.01
3 讨论
3.1 NT-3在糖尿病大鼠额叶皮质的表达 额叶皮质神经元与各叶皮质均有往返联系，额叶神经元通过抑制无关信息、选择性注意和语词输出等机制介入知觉型联想启动和知觉启动［1］，从而参与学习记忆过程。额叶皮质的神经元受损害所引起的知觉障碍称为不识症，对物体引起的触觉、视觉、听觉不能唤起记忆。糖尿病晚期病人常有认知功能障碍，主要表现为学习、记忆能力下降。许云祥等［2］通过水迷宫实验研究发现糖尿病大鼠也存在学习、记忆能力下降。
额叶皮质的神经元都是多极神经元，按其形态分为锥体细胞、颗粒细胞和梭形细胞。神经元是以分层方式排列的，一般可分为6层，从浅到深为：分子层、外颗粒层、外锥体层、内颗粒层、内锥体层和多形细胞层。本研究结果显示：NT-3阳性细胞在额叶皮质各层内弥散分布，但主要分布在皮质的外锥体层，阳性细胞主要是锥体细胞；与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠大脑皮质NT-3阳性神经元数量明显减少，染色变浅，表明糖尿病大鼠的额叶皮质表达NT-3的神经元发生了退行性变。
糖尿病大鼠额叶皮质神经元NT-3的表达减少可能是由于NT-3的自分泌和旁分泌作用均减少引起的。作为神经营养因子效应细胞的神经元，其本身具有产生神经营养因子的能力，即神经营养因子的自分泌作用［3］，糖尿病病人出现高血糖的同时，存在脂代谢紊乱，血脂升高，导致血液黏度增高，高血糖高血脂可诱使动脉粥样硬化，产生微血管病变，从而引起脑缺血，脑细胞因缺血、缺氧而变性、坏死［4］，变性、坏死的神经元的自分泌作用减少。血管内皮细胞及少突胶质细胞等也因缺血、缺氧而变性导致它们的旁
