【摘要】  目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在组织工程皮肤修复创面缺损中的作用. 方法：以标记了PKH26的MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤，修复皮肤缺损，HE染色和免疫组织化学染色观察愈合效果，荧光检测追踪细胞转归. 结果：移植2 wk后实验组创面基本愈合，愈合时间明显快于对照组，6 wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质干细胞，免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性. 结论：含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进创面愈合，骨髓间充质干细胞在皮肤创伤愈合中起了重要作用，可作为组织工程领域中理想的种子细胞.

【关键词】  骨髓间充质干细胞；皮肤；创伤愈合；组织工程

　　0引言

　　随着组织工程技术的发展，开发构建组织工程皮肤逐渐引起人们的关注，但种子细胞的来源是目前困扰组织工程的问题之一. 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是近年来研究的一个热点，它来源于中胚层，有较强的自我更新和增殖能力，且取材方便，易于培养，不涉及伦理道德等问题，因而被认为是组织工程理想的种子细胞［1］. 本研究拟用MSCs作为种子细胞经体外培养扩增后构建组织工程皮肤，修复动物皮肤缺损，观察修复效果及细胞在体内的分化，为构建具有生理功能的组织工程皮肤奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，采用Percoll（Sigma）分离法，经密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，PBS洗两次，离心收集细胞，重悬于体积分数为100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养达80%~90%融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养. 使用前用PKH26荧光染色试剂盒（Sigma）进行荧光标记. 标记好的细胞在荧光显微镜下呈单个类圆形的红色光点，显示较强的荧光. 取用荧光标记过3~5代状态良好的骨髓间充质干细胞，以1.8×106/mL的密度与提取自小牛皮的Ⅰ型胶原混合，37℃孵育30 min凝固后，加入培养液培养，2 d将其移至气液面进行器官培养，继续培养2 d获得含有MSCs的组织工程皮肤［2］.

　　1.2方法

　　1.2.1动物创伤模型制备及移植实验

　　实验用猪6只，雌雄不限，质量17~20 kg. 麻醉后背部剃毛，消毒. 在每只猪脊柱两侧皮肤各制备2个直径50 mm的圆形皮肤缺损，深至筋膜层，建立深层皮肤缺损动物模型（n=24），自体双侧对照，左右随机分为实验组和对照组. 实验组将构建的组织工程皮肤覆盖创面，敷以无菌油纱和普通纱布，打包缝合. 对照组创面未覆盖组织工程皮肤，其它治疗同实验组. 术后1 wk首次打开创面，常规换药.

　　1.2.2创面观察及指标

　　术后动物分笼饲养，每天观察活动、饮食等情况，连续观察创面变化、组织生长和创面愈合等情部至第6 wk. 定期取创面组织进行组织学观察，冰冻切片进行显微镜检查，免疫组织化学染色观察角蛋白（CK）和Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ）形成情况.

　　2结果

　　2.1骨髓间充质干细胞原代细胞接种后成圆形，首次换液后显微镜下可见稀疏分布的单个细胞贴壁生长，细胞为纺锤形，类圆形，7 d后生长速度加快，呈典型的成纤维细胞外观，约10 d汇合成片即可传代. 标记好的细胞在荧光显微镜下呈单个类圆形的红色光点，显示较强的荧光.

　　2.2组织工程皮肤光镜下可见体外培养的组织工程皮肤，与正常皮肤的真皮部分相似，表皮层缺如，真皮层较厚，但组织工程皮肤中缺少毛囊、汗腺和血管结构等.

　　2.3术后大体与组织学观察所有实验动物到实验结束均存活，饮食、排便正常，没有术后感染、化脓、体液渗出等不良反应. 在移植后1 wk，MSCs复合的组织工程皮肤与自体皮肤较好的融合，移植物颜色与自体皮肤颜色接近，随着时间延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，上皮角化不明显；移植后2 wk， 创面基本愈合，移植物颜色与自体皮肤颜色非常接近，瘢痕小，上皮增厚，角化明显，真皮层细胞生长良好，毛细血管大量增生. 对照组未完全愈合，移植区瘢痕形成，颜色较深，到移植后第3 wk才以瘢痕愈合. 实验组和对照组创面的愈合时间分别为（14.2±1.5） d和（20.4±2.7） d，两组间差异有显著性（P<0.05）.我们对新形成皮肤组织中的毛细血管进行了计数，发现在第6 wk实验组明显高于对照组（P<0.05,图1）.

　　2.4荧光检测荧光显微镜对实验组的组织标本进行连续检测6 wk，可在皮肤组织的表皮层，真皮层和皮下脂肪层的血管周围观察到标记了红色荧光的细胞.

　　2.5免疫组织化学检测术后6 wk，实验组角蛋白和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均为阳性（图2A,B）.

　　3讨论

　　皮肤移植是修复大面积皮肤缺损的最有效的方法，但无论自体或异体皮移植均受到供体来源和免疫排斥反应的限制. 随着组织工程技术的发展与应用，使利用自体干细胞在体外扩增后构建组织工程皮肤，用于创面修复成为可能将骨髓MSCs进行全身和局部植入，机体几乎没有移植排斥反应的发生，即使发生，程度也比较轻微，易于处理［3］. 有学者证明，骨髓间充质干细胞参与了皮肤创面的愈合，并且能促进经久不愈的溃疡愈合［4-5］. Nakagawa等［6］研究表明，信捷职称论文写作发表网，骨髓间充质干细胞联合碱性成纤维细胞生长因子可以加速皮肤的愈合. 已有将骨髓间充质干细胞应用于病人的报道，在深度烧伤患者的创面涂布自体的骨髓间充质干细胞悬液，能够促进皮肤再生和血管新生［7］. 在本研究中用荧光显微镜追踪骨髓间充质干细胞，在移植后6 wk的皮肤组织中，仍可以观察到标记了红色荧光的骨髓间充质干细胞，推测骨髓间充质干细胞参与了新生皮肤组织的形成. 角蛋白和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均为阳性，提示骨髓间充质干细胞生长良好并且有分化为表皮组织和真皮组织的能力. 实验组新形成皮肤组织中毛细血管的数量显著高于对照组，也有文献证明骨髓间充质干细胞有分化为血管内皮细胞的潜能［8］.

　　骨髓间充质干细胞分泌的生长因子可能是加速皮肤创伤愈合的重要原因. Liu等［9］研究表明骨髓间充质干细胞表达转化生长因子?β1，表皮生长因子，血管内皮生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子等，这些因子在调节细胞表型和创面改建中起着重要的作用.

　　本研究利用骨髓间充质干细胞构建的人工皮肤，成功修复了皮肤创面，收到了良好效果. 近年来，尽管已成功应用自体成熟细胞如成纤维细胞来修复皮肤缺损，但MSCs与这些分化的细胞相比具有更大的优势. 因为MSCs是中胚层来源的干细胞，在体外培养的过程中，MSCs可以保持未分化表型不断增殖，达到所需数量，再经诱导可分化为所需表型；另外，MSCs易于从骨髓中分离获得，避免了通过手术从患者自身获取成熟细胞所造成的二次损伤.

【参考文献】
  　　［1］Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］. Science, 1999, 284(5411):143-147.

　　［2］金岩,吕红兵,刘源,等. 人全层组织工程皮肤的研制［J］. 实用口腔医学杂志, 2002, 18(2):163-167.

　　［3］Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, et al. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow?derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): Implications for therapeutic use［J］. Bone Marrow Transplant, 1995, 16(4):557-564.

　　［4］Badiavas EV, Abedi M, Butmarc J, et al. Participation of bone marrow derived cells in cutaneous wound healing［J］. J Cell Physiol, 2003, 196(2):245-250.

　　［5］Badiavas EV, Falanga V. Treatment of chronic wounds with bone marrow?derived cells［J］. Arch Dermatol, 2003, 139(4):510-516.

　　［6］Nakagawa H, Akita S, Fukui M,et al. Human mesenchymal stem cells successfully improve skin?substitute wound healing［J］. Br J Dermatol, 2005, 153(1):29-36.

　　［7］Rasulov MF, Vasilchenkov AV, Onishchenko NA, et al. First experience of the use bone marrow mesenchymal stem cells for the treatment of a patient with deep skin burns［J］. Bull Exp Biol Med, 2005,139(1):141-144.

　　［8］方利君,付小兵,孙同柱,等. 骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究［J］. 中华烧伤杂志,2003, 19(1):22-25.

　　［9］Liu Y, Dulchavsky DS, Gao X, et al. Wound repair by bone marrow stromal cells through growth factor production［J］. J Surg Res, 2006, 136(2):336-341.