作者：王海燕,何韶衡,付意玲,方泽曼
【关键词】 蛋白酶激活受体
Expression of protease activated receptors on human lung epithelial cells
【Abstract】 AIM: To explore the expression of protease activated receptors (PARs) on lung epithelial cells. METHODS: We used RTPCR, flow cytometry and immunofluorescence cell staining techniques to observe the expression of PARs on A549 cells. RESULTS: All 4 PARs (PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4) were expressed on A549 cells. CONCLUSION: PAR1-4 are expressed on human lung epithelial cells, which may facilitate further investigation of the potential functions of PARs on lung epithelial cells.
【Keywords】 protease activated receptors；lung epithelial cell; RTPCR; flowcytometry; immunofluorescence cell staining
【摘要】 目的: 蛋白酶激活受体（proteaseactivated receptors, PARs） 广泛分布在多种组织细胞上，但4种PARs在肺上皮细胞的表达情况尚不清楚. 我们用A549细胞研究PARs在肺上皮细胞的表达. 方法:采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系A549细胞PARs的表达情况. 结果:4种PARs在肺上皮细胞上均有不同程度的表达. 结论:肺上皮细胞同时表达PAR 1~4 4种受体，这为进一步研究PARs在肺上皮细胞的功能奠定了基础.
【关键词】 蛋白酶激活受体；肺上皮细胞；RTPCR；流式细胞术；免疫荧光细胞染色
0引言
蛋白酶激活受体（protease activated receptors, PARs）属G蛋白耦联受体家族，目前共发现4个成员：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4. 蛋白酶可以酶切PAR的N末端，暴露含有系锁配体的新的N末端，可自我激活PAR功能［1］. 研究显示，PARs分布在多种组织细胞上，包括血小板、白细胞、肥大细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、消化道上皮细胞等. PAR被激活后，可介导跨膜信号转导从而参与凝血、炎症、变态反应等生理和病理过程的发生［2］. 许多组织上皮表达的PARs可能在不同的病理过程中起作用，虽然一些组织的PARs的分布已有研究，信捷职称论文写作发表网，但4种PARs在肺上皮的表达情况和功能还不是十分清楚. 因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞探讨四种PARs在肺上皮细胞上的表达特征.
1材料和方法
1.1材料
人肺癌上皮细胞系A549细胞购自中国科学院上海细胞研究所,青、链霉素、非酶性细胞分离液购于Sigma公司，DMEM培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，TRIZOL Reagent购自Invitrogen公司, TAKARA LA RTPCR kit, 购自TAKARA公司，SYBR Green I 核酸凝胶染料购自BMA公司, PCR Markers购自Biolabs公司. PE标记的小鼠抗人PAR1和PAR2 mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗体及相应的同型对照均购自Santa Cruz公司. FITC标记的羊抗兔IgG二抗购自BD Pharmingen公司. PCR仪PTC200购自MJ Research公司，激光扫描共聚焦显微镜系统购自日本Nikon公司，FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司.
1.2方法
1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞接种于50 mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100 g/L FBS，1×105 u/L青霉素和100 mg/L链霉素），于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养.
1.2.2RTPCR收集培养的A549细胞，用TRIZOL Reagent提取细胞总RNA，具体操作步骤按试剂说明进行. RNA经10 g/L琼脂糖电泳后，按TAKARA RTPCR kit说明进行cDNA合成. 逆转录的条件为：oligod(T), 42℃ 30 min，99℃ 5 min,5℃ 5 min. PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合成. βactin（F）5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′， PAR1（F） 5′CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′, PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R） 5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′， PAR3（F） 5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′, PAR4（F） 5′GGATCGCCTACCACCTGCGTG3′，（R）5′ CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′. βactin的PCR扩增条件为：94℃ 2 min,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s, 35个循环,72℃ 10 min. PAR1, PAR2, PAR3和PAR4的PCR扩增条件为：94℃ 2 min,94℃ 30 s,67℃ 30 s,72℃ 1 min, 35个循环,72℃ 10 min. PAR1, PAR2, PAR3和PAR4扩增的目的片段分别为500, 461, 403和401 bp；βactin的扩增片段为202 bp. PCR扩增片段经测序验证.
1.2.3流式细胞术分析待培养细胞生长至70%~80%时，用非酶性细胞分离液悬浮细胞，10 g/L BSA/PBS洗2次，调整细胞密度为5×109~1×1010/mL，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min,按说明书分别加入1∶20 PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、1∶20抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，4℃避光孵育30 min, 10 g/L BSA/PBS洗2次; PAR3, PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，4℃避光孵育30 min, 10 g/L BSA/PBS洗2次,最后各管均加入500 μL 1×PBS悬浮细胞，使用流式细胞仪CELLQUEST 软件检测和分析上皮细胞PAR的表达情况.
1.2.4免疫荧光细胞染色将A549细胞接种于8孔显微镜玻片培养过夜，用10 g/L BSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20 min,然后用10 g/L BSA/PBS孵育5 min，加入1∶20的PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，室温避光孵育1 h, 10 g/L BSA/PBS洗3次, PAR3，PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，室温避光孵育1 h, 10 g/L BSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦显微镜下观察.
2结果
2.1肺上皮细胞PARs mRNA的表达肺上皮细胞表达PAR1，PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，扩增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4 mRNA的长度分别为500, 461, 403和401 bp（Fig 1）.
2.2肺上皮细胞PARs蛋白质的表达流式细胞仪检测发现肺上皮细胞表达PAR1，PAR2，PAR3和PAR4，其中PAR4的表达为最强，PAR1和PAR3的表达水平较相似，PAR2的表达水平最弱. 免疫荧光细胞染色分析进一步证实上述PARs在肺上皮细胞上的表达（Fig 2）.
Fig 2Immunofluorescence staining of PARs on lung epithelial cells
图2免疫荧光细胞染色分析检测肺上皮细胞PAR的表达
3讨论
PARs家族共有PAR1，PAR2，PAR3和PAR4 4个成员，凝血酶可激活PAR1、PAR3和PAR4，而PAR2可被胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶和活化的凝血因子Ⅹ所激活［3-5］. 另外，这些受体还可被相应的PARs激动肽所激活. 其中 PAR1是凝血酶的高亲和力受体，而PAR4只能被高浓度凝血酶激活. 研究显示，凝血酶通过PAR1和PAR4途径协同互补介导血小板的活化，而PAR3作为PAR4的辅助因子，在血小板活化中也起着一定作用［6］，除参与凝血外，多种细胞类型PARs的广泛激活还可参与血管损伤反应［7,8］. PAR2的激活可参与细胞因子及炎症介质的释放,增加微血管的渗出以及中性粒细胞的趋化,血管扩张,血管收缩,细胞增殖等炎症的病理过程. 此外，在不同的生理和病理条件下，体内不同的内源性蛋白酶的存在，可能会激活同一细胞上的PAR2.
我们利用RTPCR、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术检测到了4种PARs在肺上皮细胞上的表达. 肺上皮细胞作为首先接触吸入性抗原的组织细胞之一，在变态反应性疾病的发病机制中起重要作用，它能够合成和释放许多前炎症细胞因子和趋化性细胞因子，包括IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES和eotaxin等［3,9］，还可以合成抗炎因子
