第二种是将反义基因（cDNA）连接到所需的表达载体（质粒，病毒）上，转染细胞后转录出反义RNA，并与靶mRNA互补结合，阻断转录过程，从而最终阻止蛋白的表达. 第三种是核酶，它是一种具有酶切割活性的反义核酸，与相应的mRNA结合后能发挥酶活性将其降解. 我们的实验中应用了第二种方法，即应用逆转录病毒载体重组β3AR反义RNA，成功地构建了β3AR反义RNA的重组逆转录病毒表达载体，以期在基因水平上封闭β3AR的表达，来探讨β3AR亚型在膀胱逼尿肌松弛过程中的可能价值. 在我们的实验中，因为根据相关文献［5］，β3AR无内含子成分，无法针对其中的外显子来构建载体，故此我们选择了以全长的β3AR cDNA序列为模板构建载体，来完成封闭作用.

　　目的基因的获得我们是通过RTPCR的方法. 在实验的最初我们只是基于β3AR的蛋白质编码区（CDS）设计了一对引物，并根据plncx和pUC19的多克隆位点在上下游设计了三个酶切位点，使其能通过克隆扩增后反向连接到真核表达载体中，应用此对引物进行扩增时，电泳结果在1.4 kb处有微弱亮带(目的基因为1.2 kb)，且周围有很多杂带存在，将1.4 kb泳带切胶回收后，经测序证明不是我们想要的目的基因，分析可能是引物的特异性不高，在β3AR mRNA的其他的位置亦有此引物的结合位点所造成的，故此又以5′上游及3′下游非翻译区为模板设计了一对外引物，先用外引物扩增后，再用带有内切酶的内引物进行扩增，结果得到了1.2 kb的单一片段，保证了反应的特异性.
　　
　　肾上腺素能β受体分为三种亚型，β1，β2和β3. 目前对于肾上腺素能β受体的研究，大多是应用βAR亚型选择性的受体激动剂来研究其在膀胱松弛过程中的作用［6-8］，但其选择性依赖于受体激动剂的特异性，而我们构建βAR亚型的反义真核表达载体，转录出反义的βAR，从基因水平封闭其亚型的表达，然后用非选择性βAR激动剂处理细胞以消除激动剂亲和性和效能差异造成的影响，则更加确切. 我们选用的真核表达载体pLNCX是一种逆转录病毒表达载体，相对于脂质体而言，逆转录病毒载体所介导的基因转移效率极高，最高时可达100%，并且可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体中长期表达，可以使我们能有足够的时间来观察在β3AR其他两种亚型被抑制之后的膀胱平滑肌的各种生物学特性的改变. 而后者往往由于细胞摄入率较低或进入细胞后即被降解而影响其反义抑制效果［9］. 经酶切鉴定和序列分析，本实验所克隆的βAR全长cDNA序列与Genbank上报道的完全一致且插入载体的方向也完全正确，重组病毒载体plncxβAR经双酶切鉴定，释放出1.2 kb的片段，说明βAR逆转录病毒反义真核表达载体已构建成功，这就为下一步βAR亚型功能的研究奠定了基础.

　　【参考文献】

　　［1］ Takeda M, Obara K, Mizusawa T, et al. Evidence for beta3adrenoceptor subtypes in relaxation of the human urinary bladder detrusor: analysis by molecular biological and pharmacological methods ［J］. J Pharmacol Exp Ther, 1999, 288(3):1367-1373.

　　［2］ Igawa Y, Yamazaki Y, Takeda H, et al. Functional and molecul or biological evidence for a possible β3adrenoceptor in the human detrusor muscle［J］. Br J Pharmacol, 1999, 126: 819-825.

　　［3］ Rubinstein R, Shalev M, Nissenkorn I, et al. Effect of exogenous adenosine and its monophosphate on the contractile response to acetylcholine in the human isolated detrusor muscle strips ［J］. J Auton Pharmacol, 1998, 18(2):99-104.

　　［4］ Park JS, Zhang SY, Jo SH, et al. Common adrenergic receptor polymorphisms as novel risk factors for vasospastic angina ［J］.Am Heart J, 2006, 151(4):864-869.

　　［5］ Jacob G, Garland EM, Costa F, et al. Beta2adrenoceptor genotype and function affect hemodynamic profile heterogeneity in postural tachycardia syndrome ［J］. Hypertension, 2006, 47(3):421-427.

　　［6］ Johnson M. Molecular mechanisms of beta (2)adrenergic receptor function, response, and regulation ［J］.J Allergy Clin Immunol, 2006, 117(1):18-24.

　　［7］ Fujimura T,Tamura K,TsutsumiT, et al. Expression and possible  functional role of β3adrenoceptor in human and rat detrusor muscle［J］. J Urol, 1999, 161:680-685.

　　［8］ Morita T, Iizuka H, Iwata T, et al. Function and distribution of beta3 adrenoceptors in rat, rabbit and human urinary bladder and external urethral sphincter［J］. J Smooth Muscle Res, 2000,36:21-32.

　　［9］ Duncan VE, Ajmani PS, Hughes JA, et al. Cellular delivery is a major obstacle for oligodeoxynucleotide inhibition of telomerase activity ［J］. Anticancer Res, 1998, 18: 4105-4108.

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