作者：傅永慧，沈涛，付勤，吕刚，王海义

【关键词】  脊神经根/损伤

    Alteration of Eta1 expression in spinal motoneuron resulting from spinal root avulsion

　　【Abstract】 AIM:  To explore the alteration of Eta1 expression in motoneurons following spinal root avulsion and its significance. METHODS:  Animal model of spinal root avulsion was established and immunohistochemistry and in situ hybridization were employed to investigate whether spinal root avulsion will alter the levels of Eta1 expression in the spinal motoneurons. RESULTS:  A low level of Eta1 was found in a subset of spinal motoneurons before avulsion but 3 d after avulsion, the number of Eta1expressing motoneurons increased by 52.5%, though the total number of motoneurons reduced by 31.6%. CONCLUSION:  Eta1 is unregulated in spinal motoneurons after spinal root avulsion and it may have some protective effect on motoneurons.

　　【Keywords】  Eta1; spinal cord; spinal nerve roots/injuries

　　【摘要】  目的： 探讨脊神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元中Eta1 mRNA表达的意义. 方法： 首先建立脊神经根性撕脱伤的动物模型，采用原位杂交和免疫组织化学方法检测损伤前后Eta1 mRNA在脊髓运动神经元中表达的变化.  结果： 损伤前Eta1在脊髓运动神经元中微量表达. 损伤后3 d，损伤侧脊髓运动神经元总数减少31.6%，但表达Eta1的运动神经元数量增加52.5%. 结论： 脊神经根撕脱后Eta1在脊髓运动神经元内上调表达可能是对神经元本身的一种保护.

　　【关键词】 Eta1；脊髓；脊神经根/损伤

　　0引言

　　Eta1是一种磷酸化糖蛋白［1］，在中枢神经系统的炎症［2,3］及创伤愈合过程中起到一定作用. 然而，关于脊神经根性撕脱伤后Eta1 mRNA在脊髓运动神经元中表达的变化及意义尚无相关报道. 我们建立脊神经根撕脱的动物模型，研究脊神经根撕脱是否可以改变Eta1在大鼠脊髓运动神经元中的表达水平.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性Wistar鼠8 wk龄，体质量200 g，30只. 用14 g/L氟烷及1.5 L/min O2对动物行吸入麻醉，于髂嵴上方作左旁正中切口，长约2.5 cm. 沿中线剥离左侧最长肌，并用小剪刀剪除L5横突. 将经过L5横突的L3, L4神经根与周围组织分开，用小钩将其轻轻提起，并用小血管钳将其从椎间孔拉出，逐层关闭切口，制成L3, L4神经根的椎管外撕脱模型. 术后1， 3， 7， 14或21 d处死动物. 如文献［4］所述方法，在戊巴比妥麻醉下，通过灌注泵用冷生理盐水及40 g/L的低温多聚甲醛（溶于pH7.4的PBS中）对实验鼠进行心内灌注. 收集含有L3，L4脊髓的组织块，于固定液中4℃过夜固定，然后低温保护于含200g/L蔗糖的PBS溶液中过夜. 用恒温切片机(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)切取12 μm的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载玻片上.
1.2方法Nissl染色，利用甲酚紫对切片进行染色. 原位杂交，依文献［5］所述进行体外转录. 用BamHI或XbaI 切割含有鼠ETA1 cDNA序列（核苷酸从259 到1025）的pCRⅡ质粒(Invitrogen)，使之线性化. 按照操作说明书，利用digoxigeninRNA标记物（Roche）及SP6, T7的 RNA聚合酶（Takara），信捷职称论文写作发表网，从线性化的质粒中进行正义、反义RNA探针的体外转录. 用文献［6］所述方法的改良法进行原位杂交. 以正义探针杂交组作为阴性对照. 原位杂交反应后，PBS清洗切片5 min，然后与一抗在4℃下反应过夜. 一抗为单克隆小鼠抗NeuN抗体(1∶400). 切片用PBS冲洗3次以上，每次10 min. 最后与Alexa荧光488共轭的羊抗小鼠IgG抗体反应并用荧光固定剂(Dako Cytomation, Copenhagen)固定于载玻片上. 如文献［5］所述进行免疫组化反应. 一抗是鼠抗神经细胞核抗体(NeuN; 1∶400; Chemicon International, Temecula, Calif) . 随机从切片中同侧及对侧的脊髓前角选取0.147 mm2大小的范围，计数NeuN和Eta1阳性细胞.

　　统计学处理： 采用方差分析评估组间差异，并用LSD法进行均数间的多重比较. P<0.05为有显著意义.

　　2结果

　　脊神经根撕脱伤可造成脊髓运动神经元的逐渐减少（Fig 1A, B）. 从伤后3 d起，损伤侧前角运动神经元数目开始明显减少，而同期对侧前角运动神经元的减少则不明显. 运动神经元的减少随时间显著增加，在伤后21 d时，伤侧已有50%以上的运动神经元降解，伤侧运动神经元的数量为对侧的45%（Fig 2）. 此时对侧运动神经元的减少与对照组比较也有显著差异（P<0.05）. 在正常对照组运动神经元细胞内观察到Eta1 mRNA的微弱表达（Fig 3A）. 损伤后3 d，在伤侧运动神经元细胞中的杂交信号水平升高（Fig 3B）. 在21 d时，Eta1 mRNA的表达恢复到正常水平. NeuN的荧光免疫组化及Eta1的原位杂交（Fig 4A，B）两种方法证实Eta1在运动神经元细胞的表达. 伤后3 d，比较损伤侧及对侧的前角运动神经元（NeuN阳性）表达Eta1的细胞数量，虽然伤侧NeuN阳性的神经元细胞数量减少31.6%，但表达Eta1的细胞数量增加了52.5%（Fig 5）.

　　3讨论

　　本实验提示，脊神经根撕脱后，Eta1在脊髓运动神经元中的表达上调. 虽然由于神经元的死亡，脊髓前角中NeuN阳性的神经元减少，但Eta1阳性的神经元细胞数量是增加的. 这表明撕脱伤引起运动神经元细胞中Eta1表达的上调，以此对运动神经元起保护作用. Chabas等［7］报道，在实验性自身免疫脑脊髓炎的急性期和复发期，Eta1在脑和脊髓的小神经胶质细胞及神经元细胞中均有表达，而在缓解期无表达. 因为脊神经根撕脱伤模型也可被视为中枢神经系统［8］炎性反应的模型，所以这两个独立实验的相似结果，进一步证明Eta1在神经元细胞中可能存在保护作用. 另外，在其他一些实验中发现的结果，如Eta1可以保护肿瘤细胞［9］，还能促进培养细胞的发育，防止培养的皮质神经元缺氧死亡［10］也支持这一论点.］

　　综上所述，在脊神经根撕脱伤后的运动神经元中可观察到Eta1表达的上调. 我们认为Eta1在中枢神经系统中可能存在着不同于促进炎症反应的其他功能，即保护神经元细胞抵御iNOS介导的降解的功能. 致谢： 大阪大学Dr. Shintaro Nomura提供含有Eta1 cDNA序列的质粒.

　　【参考文献】

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　　Tang HW, Pan YL, Nie YZ, et al. Construction of eukaryotic expression vector of siRNA specific for osteopontin and characterization of its efficiency in GC9811 gastric carcinoma cell line ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004;26（3）:202-205.

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　　Tao FS, Li H, Li YQ, et al. Coexisfence of calbindin D28k with parvalbumin in neurons of spinal cord anterior born in rats ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25（18）:1645-1647.

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　　［7］ Chabas D, Baranzini SE, Mitchell D, et al. The influence of the proinflammatory cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease ［J］. Science, 2001;294:1731-1735.

　　［8］ Lindholm T, Cullheim S, Deckner M, et al. Expression of neuregulin and ErbB3 and ErbB4 after a traumatic lesion in the ventral funiculus of the spinal cord and in the intact primary olfactory system ［J］. Exp Brain Res, 2002;142:81-90.

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