作者：涂玉亮,方驰华,邹玉华

【关键词】  细胞间黏附分子

    Expression and regulation of intercellular adhesion molecule1 in hepatic oval cells in rats

　　【Abstract】 AIM: To investigate the expression of intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) in hepatic oval cells (HOCs) and the regulation of nuclear factorκB (NFκB) in the expression of ICAM1. METHODS:  Wistar rats were fed on feedstuff with 0.6 g/kg 3′methyldimethylaminoazo benzene(3′MeDAB) for 4 wk, HOCs were isolated by densitygradient centrifugation and immunocytochemistry was performed to detect the expression of ICAM1. HOCs were cultured in vitro respectively with TNFα, activator of NFκB, and TGFβ1, inhibitor of NFκB, and semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) assay was used to compare the amount of ICAM1 mRNA in HOCs cultured with TNFα and TGFβ1. RESULTS:  Immunocytochemistry indicated that ICAM1 expression was positive. Compared with that in control group, the proliferation of HOCs was promoted in TNFα group (P<0.01) while it was influenced nonsignificantly in TGFβ1 group. Semiquantitative RTPCR assay indicated that the expressions of ICAM1 were upregulated in TNFα group (P<0.01) and downregulated in TGFβ1 group (P<0.01). CONCLUSION:  ICAM1 is expressed in HOCs and the expression is regulated by NFκB activity change.

　　【Keywords】 intercellular adhesion molecule1； hepatic stem cells； NFkappa B

　　【摘要】 目的: 探讨细胞间黏附分子1(ICAM1)在肝卵圆细胞(HOCs)中的表达,及核因子(NFκB)对其表达的调控作用. 方法: 0.6 g/kg 3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazo benzene, DAB）饲喂Wistar大鼠4 wk,制作肝损伤模型.利用Percoll密度梯度离心法分离HOCs,免疫细胞化学检测HOCs对ICAM1的表达；体外培养HOCs并分别用NFκB激动剂TNFα和NFκB抑制剂TGFβ1干预,RTPCR对ICAM1 mRNA进行半定量分析,比较在TNFα和TGFβ1的调控下ICAM1 mRNA表达的变化. 结果: HOCs ICAM1免疫细胞化学检测明显阳性.与对照组比较,体外培养HOCs时TNFα促进HOCs的增殖(P<0.01),TGFβ1对HOCs的增殖能力无明显影响；RTPCR半定量分析, 与对照组比较，TNFα组ICAM1 mRNA相对灰度值增高(P<0.01),而TGFβ1组ICAM1 mRNA相对灰度值降低(P<0.01). 结论: 在肝损伤组织中HOCs表达ICAM1,TNFα和TGFβ1分别通过对NFκB活性的促进和抑制来调控ICAM1的表达.

　　【关键词】 细胞间黏附分子1;肝卵圆细胞；核因子κB

　　0引言

　　近年来,肝卵圆细胞（hepatic stem cells,HOCs）的研究受到重视［1］.在大鼠肝损伤和肝癌模型的肝组织中存在HOCs大量增生［2］,但哪种细胞表达ICAM1还不完全清楚. 骨髓造血干细胞（hemopoietic stem cells, HSCs）表面存在一组以ICAM1为主的黏附分子,能介导HSCs与骨髓基质的黏附,从而使HSCs产生一种定向迁移的作用［3］. 研究表明,HOCs可以来自于HSCs.既然HOCs可以来自于HSCs,且HSCs表达ICAM1,那么HOCs也应象HSCs一样能表达ICAM1. 为此,我们研究HOCs表达ICAM1的证据及其调控.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Wistar大鼠6只,雌雄不限,体质量(110±10) g,由南方医科大学(原第一军医大学)实验动物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazo benzene, DAB）购于日本东京化成株式会社；Percoll分离液购自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC试剂盒及DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司设计合成,βantin sense primer 5′ GCATTGTAACCAACTGGGACG 3′, antisense primer 5′ TTGCCGATAGTGATGACCT 3′,扩增产物长度为535 bp；ICAM1 sense primer, 5′ CGTGCTGTATGGTCCTCG 3′, antisense primer 5′ GGGCTTGTCCCTTGAGTT 3′,扩增产物长度422 bp；Marker购于上海生工生物工程公司；总RNA提取试剂盒、mRNA逆转录酶、Taq聚合酶购于Promega公司；Ⅳ型胶原酶、TNFα, TGFβ1购于Sigma公司.

　　1.2方法

　　Wistar大鼠正常饲喂1 wk后,给予含0.6 g/kg DAB饲料饲养,正常饮水,于4 wk后大鼠1只,戊巴比妥钠麻醉(25 mg/kg, ip),开腹,门静脉切开插管,25 mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黄除去肝组织里的血液,灌注0.6 g/L Ⅳ型胶原酶至肝组织黄色糜状,将整块肝组织移入烧杯捣碎,于震荡箱37℃恒温震荡消化40 min,经100目筛网过滤,未过滤的组织块继续捣碎,加入0.6 g/L Ⅳ型胶原酶继续震荡消化40 min,收集过滤液分装于离心管中4℃ 100 g离心10 min,取上清液分装于离心管4℃ 1000 g离心30 min,弃上清液,用DMEM基础培养液稀释细胞悬液.高速离心管分装Percoll梯度离心液,细胞液铺于上层,4℃ 12 000 g离心30 min,吸取700 mL/L和500 mL/L之间细胞液,DMEM基础培养液稀释,4℃ 1000 g离心30 min,弃上清液,用150 mL/L胎牛血清稀释细胞密度至1.0×109/L. 取4个12孔培养板分别标记为A，B，C，D 4组,每组又分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亚组,每亚组4孔,各孔加入上述细胞悬液0.5 mL,然后加适量细胞培养基, Ⅰ亚组为空白对照组, Ⅱ亚组和Ⅲ亚组分别加入2.0×105 U/L的TNFα和10 mg/L的TGFβ1.分别于3，6，9，12 d计数A，B，C，D组中各1组的细胞数.

　　1.2.1ICAM1免疫细胞化学上述细胞液适量滴于防脱片处理的清洁载玻片上,培养8 h后细胞黏附贴壁.具体操作按SABC法试剂盒说明进行.光镜下观察结果.

　　1.2.2ICAM1的RTPCR取上述培养6 d的3组培养细胞分别加入不同离心管,参照试剂盒说明书按常规方法提取总RNA，将RNA沉淀于室温晾干,溶于适量无RNA酶水中.在3支0.2 mL Eppendorf管中依次加入上述总RNA 1 μL,10×逆转录酶缓冲液2 μL,AMV逆转录酶2 μL,10 mmol/L 4×dNTPs 2 μL,RNA酶抑制剂1 μL,ICAM1和βactin antisense primer等量1 μL,然后加入无RNA酶水至20 μL,充分混匀,42℃反应60 min,99℃ 5 min.PCR扩增反应:在0.2 mL Eppendorf管依次加入10×PCR缓冲液2 μL, 上述逆转录产物1 μL, ICAM1和βactin sense primer 1 μL, Taq DNA聚合酶0.5 μL,加三蒸水补至20 μL,混匀后10 000 g离心30 s,加液体石蜡20 μL.在72℃下扩增35个循环,末次循环后延伸6 min.  取各扩增产物、marker各4 μL,于琼脂糖凝胶电泳.紫外检测仪下观察并拍照结果,电泳图用GelPro analyzer 3.1进行分析. 重复检测.

　　统计学处理：数据以x±s表示，并采用SPSS 10.0统计软件进行析因设计资料的方差分析和单因素方差分析.

　　2结果

　　2.1HOCs体外培养Porcoll密度梯度离心法分离出HOCs,呈圆形或卵圆形,大小约为正常肝细胞的1/3(Fig 1). ICAM1呈明显阳性表达(Fig 2). 用TNFα和TGFβ1干预3，6，信捷职称论文写作发表网，9和12 d计数观察HOCs增殖情况,用SPSS 10.0统计软件行析因设计资料的方差分析(Tab 1),与对照组比较,TNFα干预组HOCs增殖更显著(P<0.01),而TGFβ1干预组无显著差异(P>0.05). 3组的增殖在12 d内均随时间的增多而增加(P<0.01).表1TNFα和TGFβ1对HOCs增殖能力的影响（略）

　　2.2HOCs的ICAM1 RTPCR半定量检测与对照组比较，TNFα组ICAM1 mRNA相对灰度值增高(P<0.01, Tab 2，Fig 3),而TGFβ1组ICAM1 mRNA相对灰度值降低(P<0.01). TNFα组ICAM1表达较对照组增强,而TGFβ1组较对照组减弱.表2ICAM1 mRNA灰度值（略）

　　3讨论

　　ICAM1是黏附分子免