【关键词】  鼻咽癌前病变

    Construction of transgenic mice containing human mutant p53 and EB virus latent membrane protein 1

　　【Abstract】 AIM: To establish bitransgenic mice models containing mutation p53 gene and EpsteinBarr (EB) virus latent membrane protein 1 gene （LMP1） and to provide reliable tools for studying the reciprocity of mutant p53 with LMP1 in the tumorogenesis process of nasopharyngeal precancerosis. METHODS:  Molecular cloning techniques were used to construct the recombinant plasmid pLMP1p53mt containing mutant p53 gene and EB virus LMP1 gene. Linear recombinant plasmid pLMP1p53mt was transfected into mouse androgenesis of germ cells by microinjection and then survival germ cells treated were planted into fallopian tubes of artificial pregnant female mice. Threeweek filial generation mice were screened by PCR and further identified by southern blot, and the histopathological characteristics of different tissues in 4month transgenic mice were observed by HE staining. RESULTS:  Seven hundred and seven mouse zygotes were treated with transgenic vectors DNA by microinjection and then transplanted into 30 artificial pregnant female mice. Twentysix of these mice were gravid. The transplantation rate was 86.67%. A total of 179 F0 mice were obtained, of which 9 were carried p53mt gene and LMP1 gene screened by PCR. The positive rate of transgenic mice was 5.03% (9/179). The 9 positive F0 mice carrying foreign genes were further confirmed by southern blot. The rhinal mucosa, nasopharyngeal tissues and oesophagus of one founder had inflammation and its nasopharynx mucosa had focal hyperplasia. CONCLUSION:  Transgenic mouse models integrating human mutant p53 gene and LMP1 and with focal hyperplasia of nasopharynx mucosa have been established by microinjection, which provides an effective model in studying the mechanism of nasopharyngeal precancerous lesions.

　　【Keywords】 mutation p53 gene; latent membrane protein 1 gene;  nasopharyngeal precarcinoma; transgenic mice

　　【摘要】 目的：建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型，为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具. 方法：通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1p53mt；采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中，然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产3 wk龄子代鼠进行PCR初选，再通过Southern杂交进一步确证；利用HE染色法观察4 mo龄转基因小鼠不同组织病理变化. 结果：将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射，然后植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86.67%；共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因，转基因阳性小鼠比例为5.03％(9／179)，Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠；随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症，鼻咽黏膜上皮灶性增生. 结论：成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠，且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生，可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.

　　【关键词】 突变型p53基因；LMP1基因；鼻咽癌前病变；转基因小鼠

　　0引言

　　鼻咽癌（NPC）是我国南方常见的一种恶性肿瘤，在我国南方如广东、广西、福建、湖南等省，发病率居世界首位. 在病理学上鼻咽癌表现为低分化，而临床上则表现为高转移性，其病因、发病机制尚不十分明了. 目前对鼻咽癌的预防效果不太理想，故将鼻咽组织癌变的早期诊断治疗作为鼻咽癌二级预防的主要内容具有重大意义. 缺少合适的动物模型是鼻咽癌前病变研究的主要障碍，利用基因工程技术复制鼻咽癌前病变动物可为探讨鼻咽癌前病变的机制和寻找鼻咽癌前病变的防治方法提供较理想的模型.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　双基因真核表达质粒pLMP1p53mt由本研究组在前期工作中构建［1］，包括载体pLXSN，受human cytomegalovirus启动子（PCMV）控制的p53mt基因和受EDL2启动子（PEDL2）控制的LMP1基因（图1）. 小鼠供体、受体皆为F1杂交鼠（C57BL/6J雌×CBA雄），假孕雌鼠3 mo龄，结扎雄鼠6 mo龄，上海南方模式生物研究中心繁殖，饲养于SPF级动物房.

　　限制性内切酶SpeⅠ(大连宝生物工程有限公司)；孕马血清促性腺激素(PMSG) (天津实验动物中心); 人绒毛膜促性腺激素(HCG) (上海生化制药厂)；M2，M16胚胎培养液、透明质酸酶及矿物油（Sigma公司）； PCR试剂盒（Promega公司）；小量质粒DNA抽提试剂盒（Plasmid Mini Kit tip 20）、凝胶纯化QIAGEN试剂盒（德国QIAGEN公司）；地高辛标记试剂盒、p53mt多克隆抗体和免疫组化检测试剂盒（博士德公司）；LMP1 mAb (美国Vector公司)；其他常规试剂均为国产分析纯试剂. 用Olympus倒置显微镜和体视显微镜，显微注射系统及制针设备（日本Narishige）、胚胎培养器皿（Falcon 3037，3003）、显微注射用针自制、紫外凝胶成像系统（美国BioRad公司）、紫外分光光度计（岛津，日本）、PCR扩增仪（PE公司）、高速冷冻离心机（Sigma公司）、CO2孵箱（BINDER）、超净工作台（苏净集团安泰公司）.

　　应用PCGENE软件包根据注射线性载体序列资料自行设计，共选取2对引物用于转基因阳性鼠鉴定，由上海生工生物工程技术公司和上海申友生物技术公司合成. 引物1用于PCR检测转基因动物体内的p53mt基因，上游序列为：5′CAAGATGTTTTACCAACTGGCC3′，含p53基因的突变位点，下游序列为：5′CAGCTCGTGGTGAGGCTCC3′，产物为504 bp. 引物2检测LMP1基因的整合，上游序列为：5′CGGAATTCATGGCGGCGGTGATCCACA3′，下游序列为：5′GATAGGATCCCTCGAGAGTGAGGCACA3′，扩增目的条带为782 bp.

　　1.2方法

　　1.2.1注射用双基因真核表达质粒DNA的制备转基因质粒经SpeⅠ酶切成线性，用凝胶纯化QIAGEN试剂盒回收目的片段. DNA溶解在显微注射缓冲液，其终浓度为1.7 mg/L.

　　1.2.2转基因小鼠的制备雄鼠输精管的结扎、供体鼠的超排卵及交配、假孕母鼠的准备、受精卵的采集、显微注射及移植等均参考文献［2］. 转基因被注射入C57BL/6J(雌)与CBA（雄）的杂交一代受精卵雄性原核，然后，移植入假孕母鼠输卵管. 受体鼠怀孕产出仔小鼠.

　　1.2.3转基因首建鼠的筛选①鼠尾基因组DNA的提取： 剪取出生3 wk的小鼠尾尖1.0~1.5 cm，加入0.7 mL的消化裂解液和35 μL (10 g/L)的蛋白酶，充分混匀，于55℃摇荡过夜；加入0.7 mL苯酚溶液，用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次. 室温蒸发乙醇，加入0.2 mL TE 4℃过夜，溶解DNA. ②PCR检测： 取0.5 μL DNA为模板，PCR检测基因的整合. 反应体系：10×反应缓冲液3.0 μL，MgCl2 1.5 μL，模板DNA 0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTPs 1 μL，Taq酶0.5 μL，双蒸水21.5 μL，总量30 μL. 利用引物1检测p53mt基因时，信捷职称论文写作发表网，参考文献［3］，反应条件：94℃ 4 min，97℃ 40 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；94