℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 8 min，扩增目的条带为504 bp；引物2检测LMP1基因整合时，反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，72℃ 50 s，35个循环，72℃ 8 min，扩增目的条带为782 bp，10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果. ③小鼠基因组DNA的Southern blot检测： 取PCR阳性的小鼠基因组DNA 20 μg，以同种普通小鼠基因组DNA及注射用外源基因作为阴性对照和阳性对照，以内切酶BamH I充分消化，8 g/L琼脂糖凝胶电泳后转移至尼龙膜. DNA杂交：以EDL2为探针，按照“DNA随机引物标记试剂盒”所述方法以地高辛标记探针. 信号检测：参照地高辛检测试剂盒的方法进行.

　　1.2.4病理组织学Southern杂交阳性的转基因小鼠注射250 g/L乌拉坦麻醉后，取鼻腔黏膜、鼻咽组织、肺、食管、胃、大肠、肝、肾、脾组织于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上，进行脱水，透明，石蜡包埋，切片，切片厚4 μm，HE染色，光学显微镜下阅片，观察病理变化.

　　2结果

　　2.1DNA显微注射注射片段回收后，用注射用TE稀释至1.7 mg/L，在显微注射仪下将该片段导入小鼠受精卵的雄性原核中. 共注射了707枚受精卵，将其移植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86.67%；共出生子代鼠179只.

　　2.2PCR检测利用PCR从中筛选出9只携带p53mt基因（图2）的小鼠（3只雌性，6只雄性），分别为19号，44号，63号，73号，74号，99号，103号，131号，133号，同时用LMP1基因引物扩增也为阳性（图3），阳性率为5.03%. 这些转基因小鼠不是同一批检测.

　　2.3Southern杂交检测将PCR阳性的LMP1p53mt首建鼠尾DNA进行Southern blot检测，确证9只小鼠均为阳性（图4）.

　　2.4病理学转基因小鼠鼻腔黏膜、鼻咽组织、肺、食管、胃、大肠、肝、肾、脾组织HE染色观察，鼻腔黏膜、鼻咽、食管等出现炎症，鼻腔黏膜有中性粒细胞浸润；鼻咽组织也有中性粒细胞浸润，并且表现出黏膜上皮灶性增生；食管出现中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润（图5）. 其他部位未出现明显病变.

　　3讨论

　　野生型p53基因参与细胞周期的调控，阻止细胞从G1期进入S期；对细胞分裂和增殖起负调节作用，同时还能够诱导细胞出现凋亡，被认为似“分子警察”那样监视着细胞DNA的完整性. 突变型p53基因不但丧失了抑癌活性，反而具有促进恶性转化的功能，导入突变型p53基因小鼠为高度肿瘤易感性，约有20%小鼠诱发肿瘤.

　　LMP1是EBV基因组编码并在鼻咽癌组织中表达的与细胞转化有关的少数几个蛋白质之一，在EBV致癌过程中起重要作用. 现已建立的EBV相关转基因动物模型主要以LMPl为研究对象. LMP1转基因小鼠可诱发B淋巴细胞瘤［4］，但未见鼻咽癌发生的报道，转基因鼠的鼻咽组织中亦未检测到LMP1的表达，于是学者们把目光投向鼻咽组织特异性启动子的研究上.

　　EDL2启动子存在于EBVBNLF1基因的下游，Nakagawa等［5-6］用该启动子与周期蛋白D1 cDNA的融合基因建立转基因小鼠，在转基因小鼠的舌、食道、前胃及皮肤等组织中检测到周期蛋白D1的表达，且多位于基底层或基底上层复鳞上皮. 体外研究也显示在鳞状上皮细胞系TE11（食道鳞癌细胞系）、SCC13（人皮肤鳞癌细胞系）、SCC25（舌鳞癌细胞系）中EDL2有很高的活性，证实其为鳞状上皮特异性启动子［7］. 杨玉芳等［8］将该启动子导入了小鼠. 张玲等［9］采用受EDL2, PLUNCp双启动子调控鼻咽癌来源的LMP1的表达载体，构建转基因小鼠，在转基因小鼠的鼻咽、前胃、舌根等部位检测到了外源基因的表达，但是未观察到鼻咽组织明显的病理改变，推测可能由于转基因表达时间较短（4 mo）.

　　本研究利用可调控基因在鼻咽组织表达的相对特异性启动子构建人突变型p53基因和LMP1基因的鼻咽癌前病变小鼠模型. 转基因小鼠检测结果表明在所获得的179只首建转基因小鼠中，9只PCR阳性，再经Southern杂交鉴定，未发现有假阳性. 早期的转基因研究中，一直将Southern杂交作为阳性鼠的最终结论. 实践证明，通过严谨、合理的设计，PCR鉴定完全可以作为最终结论.
对其中一只雄性首建鼠（4 mo龄）进行病理组织学检查，其鼻腔黏膜、鼻咽、食管等表现出炎症，鼻腔黏膜有中性粒细胞浸润；鼻咽组织也有中性粒细胞浸润，并且表现出黏膜上皮灶性增生；食管出现中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润. 其他部位未出现明显病变. 说明EDL2相对特异性启动子控制LMP1基因的表达以及p53mt基因的共同作用，能获得鼻咽癌前病变的动物模型.

　　【参考文献】

　　［1］ 何迎春,田道法,刘书静,等. 质粒pLMP1p53mt的构建与表达［J］. 中国医学工程，2005,13（3）：243-246.

　　［2］ 孙晗笑. 转基因技术理论与应用［M］. 郑州：河南医科大学出版社，2000:146-209.

　　［3］ 何迎春,田道法,唐发清. PCR筛选转基因小鼠实验体系的优化［J］.中华中西医临床杂志，2005,5（2）：162-164.

　　［4］ Kulwichit W, Edwards RH, Davenport EM, et al. Expression of the EpsteinBarr virus latent membrane protein 1 induces B cell lymphoma in transgenic mice［J］.  Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95（20）:11963-11968.

　　［5］ Nakagawa H, Wang TC, Wilson J, et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an EpsteinBarr virus promoter in transgenic mice cause dysplsia in the tongue, esophagus and forestomach［J］. Oncogene,1997,14(10):1185-1190.

　　［6］ Jenkins TD,Nakagawa H, Rustgi AK.The keratinocytespecific EpsteinBarr virus EDL2 promoter is regulated by phorbol 12myristate 13acetate through two cisregulatory elements containing Ebox and Kruppellike factor motifs［J］. Biol Chem,1997,272(39):24433-24442.

　　［7］ Nakagawa H，Inomoto T, Rustgi AK. A CACCC boxlike cisregulatory element of the EpsteinBarr virus EDL2 promoter interacts with a novel transcriptional factor in tissuespecific squamouse epithelia［J］.J Biol Chem,1997,272(26):16688-16699.

　　［8］ 杨玉芳，丁彦青，石益民，等. 嗜上皮细胞特异性启动子EDL2转基因小鼠的建立［J］. 第四军医大学学报，2003,24(21):1953-1955.

　　［9］ 张玲，蓝轲，姚开泰，等. 用鼻咽相对特异性调控区建立NLMP1转基因小鼠［J］. 生物化学与生物物理学报，2003,35（12）：1072-1076.