作者：王剑，桑宏勋，王臻，郭征

【关键词】  树突细胞；肉瘤,Ewing；总RNA；逆转录聚合酶链反应；癌症疫苗

    【Abstract】　AIM: To investigate RNA expression of dendritic cells(DC) pulsed with totol RNA from Ewing sarcoma cells. METHODS: DC was generated from the peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of Ewing sarcoma patients. Surface markers of matured DCs was detected by flow cytometer(FCM). Total RNA was isolated from Ewing sarcoma by Trizol. DC were transfected with total tumor cell RNA. The expression of DC tansfected with total RNA was measured by RTPCR method. RESULTS: Surface markers of DC pulsed with total RNA  changed apparently. CD40 increased from 32.24% to 72.32%. CD83 increased from 17.39% to 30.97%,  while monocyte CD14 declined from 26.37% to 10.46% .This indicated the significant reinforcement of antigen presentation of DC. RTPCR showed the specific sequence EWSFLI1 of Ewing sarcoma can be combined with the primer specifically at the best temperature of 54℃. CONCLUSION:  DC pulsed with total RNA of Ewing sarcoma cells can present tumor specific antigen and express its characteristic sequence EWSFLI1 specifically.

    【Keywords】　dendritic cells; sarcoma, Ewings; total RNA; reverse transcriptase polymerase chain reaction; cancer vaccines

    【摘要】　目的： 探讨树突状细胞（DC)经尤文肉瘤细胞总RNA加载后的体外RNA表达情况. 方法： 采用分离尤文肉瘤患者外周血单核细胞体外诱导DC,用流式细胞仪检测DC成熟后的表面标志，Trizol法提取患者尤文肉瘤组织总RNA,用总RNA转染DC，用RTPCR方法检测肿瘤总RNA加载的DC的表达. 结果： 经尤文肉瘤总RNA加载的DC表面标记发生明显变化，DC的特异性表面标志如CD40由32.24%增高至72.32%,CD83由17.39%增高至30.97%,而代表单核细胞的CD14则由26.37%下降至10.46%，标志其抗原呈递功能显著增强. RTPCR测定显示尤文肉瘤中的特异性序列EWSFLI1可以和引物特异性结合，并且最佳结合温度为54℃. 结论： 尤文肉瘤细胞总ＲＮＡ转染的DC可以呈递肿瘤特异性抗原，并特异性的表达其特有序列EWSFLI1.

    【关键词】　树突细胞；肉瘤，Ewing；总RNA；逆转录聚合酶链反应；癌症疫苗

       0引言

    细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Ｔ lymphocytes, CTL)能够介导特异性免疫应答,引导特异性肿瘤细胞杀伤效应. CTL的特异性免疫应答依赖于肿瘤抗原的存在,肿瘤抗原被抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC)识别吞噬后,在抗原递呈细胞内加工处理形成特定的多肽片段,与MHCＩ类分子完全匹配后递呈到细胞表面,被相应Ｔ细胞受体(T cell receptor, TCR)识别,形成肿瘤抗原多肽MHCTCR复合物,在协同刺激因子的共同作用下,激活特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞,产生免疫反应、清除肿瘤细胞［1］. 树突状细胞（dendritic cells, DC)是体内最重要的专职抗原递呈细胞［2］,可由骨髓干细胞、外周血干细胞及外周血单个核细胞在细胞因子作用下诱导扩增. 95%的尤文肉瘤家族具有特异的染色体异位,从而形成的EWSFLI1融合基因是尤文肉瘤家族发生、进展的主要原因［3］. 本研究从尤文肉瘤患者外周血中分离单个核细胞在IL4和GMCSF诱导下分化扩增DC,从患者尤文肉瘤组织中提取肿瘤总RNA加载DC,并对经总RNA加载后的DC进行鉴定，确定经肿瘤RNA加载的DC持续表达相应特异性肿瘤抗原,为DC在尤文肉瘤生物学免疫治疗中的临床应用提供实验依据.

    1材料和方法

    1.1材料RPMI1640 (美国GIBCO公司,14.1 g/包)；胎牛血清（杭州四季青,250 mL/瓶）；IL4（美国R＆D 公司,lot#AG131091,14.45×105 U/5 ug/mL stock）；rhGMCSF（海南通用同盟药业有限公司,150 ug/支）；Trizol(美国GIBCO公司)；OligodT(美国GIBCO公司)；血细胞分离机 (瑞典GAMBRO.BCT)；梯度PCR仪(德国Eppendorff公司)；流 式 细 胞 仪(美国Beckman Coulter公司)；尤文肉瘤瘤体标本由第四军医大学西京医院骨科2005年收治患者自愿提供（已签知情同意书）； PCR引物由北京三博生物技术公司合成正向序列为5′CCACTAGTTACCCACCCCAAACTG3′，反向序列为3′GTGATACAGCTGGCGTTGGCG5′.

    1.2方法

    1.2.1尤文肉瘤细胞总RNA提取手术无菌切除活力好的尤文肉瘤组织，将其平均切成1 mm3大小的组织块，研磨后加Trizol 2 mL消化2 h,将消化好的细胞裂解液吸入2 mL装的离心管中，加氯仿0.2 mL，静止2 min，然后进行离心，离心设定为： 8160 g, 4℃, 15 min, 取上清无色水相0.8 mL，装入新的2 mL装的离心管中，加0.5 mL异丙醇，静置10 min，然后再次离心，离心设定为：8160 g, 4℃，10 min, 观察总RNA为管底的白色沉淀，用DEPC水溶RNA，并测RNA浓度为4 μg/μL.

    1.2.2DC的体外培养利用血细胞分离机（分离管道：去除白细胞装置管路；分离程序： MNC程序）采集尤文肉瘤患者外周血中的单个核细胞. 将获得的单核细胞移入6孔培养板内进行贴壁培养，密度为: 1×108/孔,培养液为： RPMI1640(10 g/L  L谷氨酰胺, 10 g/L非必需氨基酸,10 g/L 丙酮酸钠,100 mL/L 胎牛血清)，37℃, 50 mL/L CO2孵箱贴壁2 h,后用PBS洗涤液洗去未贴壁的细胞（大部分为小的淋巴细胞），然后加新鲜培养液：RPMI1640＋IL4(800 U/mL)＋GMCSF(800 U/mL)，37℃,50 mL/L CO2孵箱中继续培养6 d，第2日和4日更换新鲜培养液：RPMI1640＋IL4(800 U/mL)＋GMCSF(800 U/mL).

    1.2.3总RNA加载DC在DC培养的第5日，在实验组中以10 mg/L的比例加入总RNA ,放入孵箱中培养过夜. 在DC培养的第6日，在对照组中不加入总RNA进行加载.

    1.2.4DC的成熟诱导预先在两个100 mm Petri培养皿中分别接种5×107的单个核细胞，2 h后吸弃其中的非黏附细胞,37℃, 50 mL/L CO2继续培养24 h，收集上清即为成熟DC条件培养液 (preparation of monocyte conditioned medium, MCM)，在实验组中加入MCM，放入孵箱继续培养36 h，在对照组中部分加入MCM，部分则不加MCM.

    1.2.5总RNA加载DC的鉴定

    1.2.5.1培养前后DC表面标记的测定收集实验组和对照组两组细胞各分成5小组，每小组再分成6等份，用PBS调成5×105/10 μL，加入FITC标记的mAb(CD14, CD40, CD83, CD86, HLA DR),4℃避光染色1 h,续加二抗，4℃避光染色1 h，洗涤后用10 mL/L多聚甲醛固定,流式细胞仪分析.

    1.2.5.2总RNA加载DC的RTPCR测定 RTPCR检测分为3组： 取3个PCR小管，设为a,  b,  c，各加入2 μL OLigo dT,然后在3个小管中分别加入2 μL . a: 经肿瘤总RNA加载的DC总RNA; b: 未经肿瘤总RNA加载的DC总RNA; c: 肿瘤组织的总RNA. 紧接着3管均补水至11 μL，70℃, 5 min，快速入冰中5 min，室温离心8160 g. 继续在3管中各加入5×buffer 5 μL, dNTP(10 mm/mL) 2.5 μL, AMV RT (10 u/n) 1.5 μL,DEPC水 5 μL. 使总体系达到25 μL ，然后将3个小管置于42℃ 1 h，即成cDNA.  将以上三种cDNA置于梯度PCR仪上进行PCR检测，设定： 退火温度94℃，解链温度：56.5℃,延伸温度： 72℃. 共35个循环 . 最后对RTPCR产物再进行琼脂糖凝胶电泳.

    统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS8.0统计软件采用t检验进行数据分析， P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1培养前后DC表面标记流式细胞仪分析结果显示加载了总RNA的DC与不加载总RNA的DC表面标志有差别. DC的特异性表面标志如CD40, CD83在加载了总RNＡ后表达增高，HLADR,共刺激分子CD86表达也增高